191108. lajstromszámú szabadalom • Eljárás M 9026 jelű antibiotikum-komplex komponensek előállítására
11 191 108 12 tákká vagy kis hengerekké préselhetjük és bőr alá vagy izomba beültethetjük. A beültetett készítményekben használható semleges anyagok lehetnek biológiailag lebontható polimerek vagy szintetikus szilikonok, például a Dow Corning Corporation által gyártott Silastic szilikongumi. A találmány tárgya eljárás gyógyászati készítmény előállítására, a találmány szerinti hatóanyagot a farmakológiailag elfogadható hordozókkal keverve. A következő' példákban a szakember számára ismertetjük a szabadalmi eljárás gyakorlati végrehajtását. Az ultraibolya és látható spektrumokat Perkin- Elmer 320 UV/Vis spektrométerrel vettük fel. A tömeg-spektrometriás adatokat egy Hitachi-Perkin-Elmer RMU-6L tömegspektrométerrel vettük fel. A mágneses magrezonancia spektrumokat CDCI3- ban, belső standardként TMS-t használva vettük fel 270 MHz-en egy Uruker W1I-270 spektrométerrel. 1. példa A Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzs fermentációja A Micromonospora sp. NRRL 15 118 törzs tenyészetét előtenyésztjük a következő összetételű' táptalajban, rázott lombikban növesztve a törzset: élesztő, kivonat 5g húskivonat . 3 g tripton 4g glükóz 1 g keményítő 24 g kalcium-karbonát 4 g csapvíz 1000 ml-re feltölteni. A lombikokat 48 órán át 30 °C-on tartjuk és az előtenyészetet használjuk 1 liter, következő összetéteiű táptalajt tartalmazó üvegfermentor oltására: élesztő, kivonat 2 g kazein-hidrolizátum 4 g húskivonat 2 g glükóz lOg keményítő 20 g kalcium-karbonát 3 g csap víz 1000 ml-re feltölteni. A fermentációt süllyeszlett-levegőztetett körülmények között, kevertetve, 26-30 °C között hajtjuk végre. A pH-t 6,0 és 8,5 között tartjuk. Az antibiotikum aktivitást Staphylococcus aureus teszt-organizmust alkalmazva időnként mikrobiológiailag, az agardiffúziós módszerrel ellenőrizzük. A legmagasabb aktivitást 72 óra után érjük el. 2. példa Az M 9026 antibiotikum-komplex kinyerése Az 1. példa szerint előállított fermentlevet leszűrjük. A szőriét pH-ját 7-re állítjuk és kétszer extraháljuk azonos térfogatú elil-aceláttal. A szerves exlraktumokat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson az eredeti térfogatnak körülbelül egy századára sűrítjük. A keletkező csapadékot szűréssel kinyerjük. lia etil-étert adunk az anyahighoz, ugyanabból az anyagból további mennyiséget kapunk. Szűrés után a kinyert szilárd anyagot csökkentett nyomáson, szobahőmérsékleten szárítjuk, így kapjuk a nyers M 9026 antibiotikum-komplexet. 3. példa Az M 9026 antibiotikum 1. jelű komponensének kinyerése A fermentlé szűrésével kapott micélium-tömeget vízzel mossuk, a pH-t körülbelül 7,0-re állítjuk és a keveréket metanolban szuszpcndáljiik, majd 20 percig kevertetjük. A keveréket leszűrjük és a metanolt ki desztilláljuk a szűrletből. Az így nyert vizes fázis pH-ját 7,0-re állítjuk és a fermentlére leírt módon etilacetáttal extraháljuk. A nyert M 9026 antibiotikum 1. jelű komponensét a 4. példában a 2. és 3. komponensre leírt módon tisztíthatjuk. Fizikai-kémiai tulajdonságait az előbbiekben ismertettük. Hasonló eredményeket kapunk, ha a fenti eljárásban az etilacetátot kloroformmal vagy metil-etil-ketonnal helyettesítjük. 4. példa Az M 9026 antibiotikum komplex tisztítása 1,5 g, az 1. példa szerint előállított nyers komplexet 10 ml eluáló elegy ben oldunk és 120 g Kiesel-gél 60-ból (70-230 mesh, ASTM, Merck) kloroform:metanol : ammónia 66:30:4 arányú elegyben készített szilikagél kromatográfiás oszlopra visszük. Az oszlopot 60:30:4 térfogatarányú kloroformmetanol: ammónia eleggyel kifejlesztjük és 15 ml-es frakciókat szedünk. Az oszlopról lejövő minden egyes frakciót IIL 60 sejtek, Staphylococcus aureus vagy Ikieillus sublilisszal szemben aktivitásra megvizsgálunk, valamint vékonyréteg-kromatográfiás bioautográfiával, Staphylococcus aureust használva kimutató organizmusként. A frakciókat aktivitásuk alapján egyesítjük. Az egyesített, besűrített frakciókhoz dietilétert adunk a tisztított M 9026 antibiotikum komplex kicsapására. Ebben az utolsó lépésben diizopropil-étert vagy petrolétcrt is használhatunk. Ennek a terméknek fizikai-kémiai tulajdonságait a fentiekben ismertettük. 5. példa Az M 9026 antibiotikum 2. és 3. komponensének elválasztása A 4. példában előállított 340 mg tisztított M 9026 komplexet 5 ml diklórmetán: metanol 9:1 térfogatarányú elegyében oldjuk. 5 10 '15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
