191108. lajstromszámú szabadalom • Eljárás M 9026 jelű antibiotikum-komplex komponensek előállítására
5 191 108 6 jék, a termelő tartályon keresztül előnyösen olyan mennyiségű levegőt buborékoltatunk, hogy az elegendő legyen több mint 20 %-os oldott-oxigén szint fenntartásához. A fermentáció során az antibiotikum-termelést követhetjük a fermentléből és/vagy a micélium-kivonatból vett minták antibiotikus aktivitásának mérésével. Erre a célra az M 9026 antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmusok használhatók. Egy különösen jól használható organizmus a Staphylococcus aureus. Más hasznos mérő-organizmusok lehetnek azok a sejtek, amelyekről ismert, hogy érzékenyek az említett antibiotikumok citotoxikus aktivitására. A biológiai vizsgálatot könnyen elvégezhetjük az agar-diffúziós módszerrel agarlemezeken vagy vékonvréteg-bioautográfiával. A maximális antibiotikum aktivitás a fentiekben körvonalazott fermentációs körülmények között általában az inkubálás 48—72. órájában jelenik meg. Süllvesztett-levegőztetett fermentációs körülmények között történt előállítás után az M 9026 antibiotikumokat a fermentációs iparban használt módszerekkel nyerhetjük ki a fermentléből, például oldószeres extrakcióval, ellenáramú extrakcióval, szerves kicsapószerek alkalmazásával, oszlop-kromatográfiával, vékonyrélcg-kromatográl'iával és hasonlókkal, majd tovább tisztíthatjuk oldószeres átkristályosítással, folyadék-kromatográfiával, nagynyomású folvadék-kromatográfiával, fordított fázisú folyadék-kromatográfiával és hasonlókkal. Az M 9026-ot termelő szervezetek fermentációja során előállított antibiotikumok a tenyészlében és/vagy a micélíum-tömegben találhatók. Ennélfogva az M 9026 antibiotikumok kinyerésére előnyösen alkalmazható a szűrt fermentlé és a micélium-tömeg külön-külön extrakciója. A micéliumot szűréssel eltávolítva az M 9026 antibiotikumokat megfelelő szerves oldószerrel extrahálva nyerhetjük ki a szíírletből. Az extrakciót általában a szűrlet pH-jának 3,5 és 8,5 közé állítása után végezzük el, előnyösen pH 6,0—7,5 között, még előnyösebben pH 7,0-en. Az alkalmazható szerves oldószerek az M 9026 antibiotikumokat oldó, de vízben nem oldódó oldószerek, jellemző, de nem korlátozó példák a következők: rövid szénláncú alkanolok, például metanol, etanol, propanol és hasonlók, rövid szénláncú haloalkánok, például kloroform, diklórmetán, klóretán és hasonlók, rövid szénláncú alkil-észterek, például etilacetát, butilacetát, propilacetát, etilpropionát, etil- Initirát és hasonlók, valamint ketonok, például mctilctii-keton és hasonlók. Az extraktumokat kis térfogatra sűrítjük és a kicsapódó szilárd anyagot szűréssel kinyerjük. A kicsapódás teljessé tehető egy második, az M 9026 antibiotikumokat nem oldó szerves oldószer hozzáadásával, például petroléterrel, etiléterrel vagy hasonlóval. Ezzel szemben a kiszűrt micéliumot vízzel mossuk és a fentiekben említett, az M 9026 antibiotikumok extrahálására alkalmas oldószerek egyikében szuszpendáljuk. Keverés után a keveréket leszűrjük és a szerves oldószert kihajtjuk a színidből. A megmaradó vizes elegy pH-ját ezután 3,5—8, előnyösen 6 és 7 közé állítjuk és a fermentlére leírt módon extraháljuk. A kapott M 9026 antibiotikumokat tovább tisztíthatjuk ismert' tisztítási eljárásokkal, előnyösen vékonvréteg-kromatográfiát vagy oszlopkromatográfiál alkalmazva. Töltetként alumínium-oxid, szilikagél, ioncserélő gyanták, például DowexR gyanták, cellulóz, SephadexR és hasonlók használhatók előnyösen. A találmány előnyös kivitelezése során az M 9026 komplex tisztítását szilikagél oszlopon végezzük, eluálósz.crkéut poláris oldószer, például rövid szénláncú alkanol, rövid szénláncú halo-alkán, például kloroform és bázisos anyag, például ammónium-hidroxid elegyét alkalmazva. A találmány még előnyösebb kiviteli formájában kloroformunetanol-ammónia 66:30:4 arányú elegyét használjuk eluálásra. A fentiekben meghatározott biológiai vizsgáló rendszerben mikroba-ellenes hatást mutató eluátumfrakciókat összegyűjtjük és az M 9026 antibiotikum komplexet kinyerjük a fentiekben leírt technikák egyike szerint. Az M 9026 2. és 3. komponensének elválasztását több ismert módszerrel is elvégezhetjük, ezek lényegében kromatográfiás eljárásokon alapszanak. Oldószeres extrakciót, oldószeres kicsapást ellenáramú extrakciót és hasonló eljárásokat is használhatunk. Másik előnyös kiviteli mód szerint oszlopkromatográfiát alkalmazunk; előnyösen szilikagélt használunk töltetnek és az előnyösen alkalmazható eluáló elegy poláris oldószerből, például rövid szénláncú alkoholból és kis polaritású oldószerből, például rövid szénláncú halo-alkánból áll. Az előnyös eluáló elegy összetétele kloroform-metanol 9:1 arányban. Az eluátum frakcióit összegyűjtjük, vizsgáljuk a fentiekben említett biológiai módszerrel és a megfelelő frakciókat összeöntjük. Az M 9026 antibiotikum 2. és 3. komponensét az M 9026 komplexnek az extrakciós elegy bői történő kinyerésére leírt módszerek egyikének alkalmazásával nyerjük ki. Az M 9026 antibiotikum komplex és az M 9026 antibiotikum komplex I., 2., 3. jelű komponenseinek fiziko-kémiai tulajdonságai. M 9026 antibiotikum komplex A nujolban felvett infravörös elnyelési spektruma az 1. ábrán látható. A következő elnyelési maximumok (cm-1 ) figyelhetők meg: 3260 (széles)', 3060, 2730, 1735, 1720 (váll), 1650, 1630, 1545, 1515, 1495, 1300, 1260, 1210, 1170, 1090, 1030, 980, 940, 830, 760, 720, 700. Az ultraibolya spektrum metanolban terminális elnyelést mutat 215 nm-nél és a kísérő rajzok között a 2. ábrán látható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
