190999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonint termelő törzsek előállítására
1 190 999 2 azoknak a géneknek a működését, amelyek a tetraciklinnel szembeni ellenállóképességet határozzák meg. Ennek következtében a pYN6 plazmidot tartalmazó sejtek ellenállnak ennek az antibiotikumnak. A treonin-operon különböző génjeiben mutációkat tartalmazó Escherichia coli törzseknek a pYN6 plazmiddal történő transzformációja azt mutatja, hogy ebben a plazmidban a treoninoperon mindhárom génje jelen van és működik. ■ Treonint termelő törzs előállításához a kapott pYN6 hibridplazmidot használjuk, amellyel a 'thrC 1010 és ilvA 442 mutációkat hordozó befogadó Escherichia coli VL334 törzset transzformáljuk. A thr C1010 mutáció zavarja a treoninszintézist, és ezáltal lehetővé válik hibridplazmidot tartalmazó transzformánsok kinyerése. Az ilvA 442 mutáció részlegesen blokkolja a treonin metabolizmusának szomszédos szakaszát - ez az első reakció a treoninnak izoleucinná történő átalakulása során - és így zavarja a treonin átalakulását s az izoleucin szintézisét (az izoleucin részt vesz a treonin-operon repressziójában). Az izoleucin szintézisének blokkolása nem teljes azonban, és ellensúlyozható a sejt nagyobb treonintartalmával. A pYN6 plazmidot tartalmazó transzformánst olyan táptalajon különítjük el, amely 500 mikrogramm/ml penicillint és 20 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmaz, treonin és izoleucin azonban nincs jelen. A kapott törzs neve Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6). A törzs ellenáll penicillin és tetraciklin behatásával szemben, és aminosavakat nem tartalmazó táptalajon is képes a növekedésre. A törzsnek az a képessége, hogy izoleucin nélkül is növekedni tud, összefüggésben van azzal, hogy igen nagy a treonintartalom az Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6) törzs sejtjeiben. Ez a képesség a mutáns treonin-operon amplifikációjának a következménye. így szelektív módon előnyben részesülnek a hibridplazmidot hordozó sejtek azokhoz a sejtekhez képest, amelyek a hibridplazmidot elveszítették. A kapott Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6) törzs sejtjei kromoszómánként a pYN6 plazmidnak körülbelül 10 másolatát tartalmazzák. A 3. példában adjuk meg azokat az eredményeket, amelyeket a törzs aminosav-termelőképességének vizsgálata során kaptunk. 2. példa Az 1. példában leírtak szerint nyert pYN6 pYNIO plazmidot Hind III és Bam Hl specifikus endonukleáz enzimekkel kezeljük. Az enzimeket 65 °C-on 10 percig történő melegítéssel inaktiváljuk, majd az elegyet T4 fág polinukleotidligázzal •kezeljük. A kapott készítménnyel transzformáljuk a C600 baktériumtörzset, és Ap'TcThr1' fenotípusú kiónt választunk ki. Az önkényesen kiválasztott kiónból 5,7 megadalton molekulasúlyú, pYN7 jelzésű plazmidot különítünk el. Amint az a restrikciós analízis mutatja, amikor ezt a plazmidot Hind III és Bam Hl endonukleázokkal elhasítjuk, két töredéket kapunk, amelyek közül az egyik a pBR.322 plazmid (molekulasúlya 2,7 megadalton) jelentős részének felel meg, míg a másik a VNIIgenetika MG442 törzs DNS-kromoszómájának egy töredéke (molekulasúlya 3,0 megádalton). A restrikciós analízis eredménye az 5. ábrán látható. A pYN6 plazmid vázlatos rajzán ezeket a töredékeket a szaggatottan kihúzott körívek jelképezik (lásd a 4. ábrát). A treonin-operon különböző génjeiben mutációkkal rendelkező törzsek pYN7 plazmiddal történő transzformációja azt mutatja, hogy ebben a plazmidban a treonin-operon mindhárom génje működik. T-eonint termelő törzs előállításához a pYN7 plazmidot alkalmazzuk az Escherichia coli VL334 törzs transzformációjára. Ez a törzs mutációkat hordoz a thrC és ilvA génekben. A transzformációval nyert terméket, amely átvette a pYN7 plazmidot, olyan közegen különítjük el, amely treonint és izolcucint nem, azonban 500 mikrogramm/ml penicillint tartalmaz. Az így nyert törzs elnevezése Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7). Ez a törzs ellenálló penicillinnel szemben, és aminosavakat nem tartalmazó táptalajban is képes növekedésre. A nyert VNIIgenetika VL334 (pYN7) törzs sejtjei kromoszómánként körülbelül 320 másolatot tartalmaznak a pYN7 plazmidból. A 3. példában adjuk meg azokat az eredményeket, amelyeket a törzs aminosav-termelőképességének vizsgálata során kaptunk. 2. példa Az 1. és 2. példában leírt eljárással kapott Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6), Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7) és Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzsekkel, az aminosav-termelőképesség összehasonlítása céljából beoltunk - 0,5 mg/ml benzil-penicillin-káliumsót tartalmazó ferde Adams-féle agar-agar táptalajról (1,0 g/1 NH4C1, 1,5 g/1 KH2P04, 3,5 g/1 Na2HP04, 0,2 MgSO4.7H2O + 20 g/1 agar) oltókacs segítségével - 250 ml-es Erlenmeyer lombikokban elhelyezett 30 ml folyékony, 1 % glükózt tartalmazó Adams-féle táptalajt. Beoltás után a lombikokat forgó rázógépbe helyezzük (200 fordulat percenként), és 18 órán át végezzük az inkubálást 37 °C- on. \z így nyert oltóanyag 1-1 ml mennyiségével beoltjuk az előzetesen sterilizált fermentációs táptalajokat, (1-3. számú), amelyekből mindig 15 ml-t töltünk 250 ml térfogatú Erlenmeyer lombikokba. A fermentációs táptalajok összetétele az alábbi: 1. számú táptalaj: 30 g/1 glukóz, 10 g/1 ammóniumszulfát, 2 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g/1 magnézium-szulfát, 20 g/1 kálcium-karbonát. 2. számú táptalaj: 50 g/1 glukóz, 15 g/I ammóniumszulfát, 2 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g/1 magnézium-szulfát, 20 g/1 kálcium-karbonát. 3. számú táptalaj: 80 g/1 glukóz, 20 g/1 ammónium-szulfát, 2 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g/1 magnézium-szulfát, 30 g/1 kalcium-karbonát. A fermentációs táptalajokat autoklávban sterilizáljuk, 0,5 at túlnyomáson, 15 percig. A kalciumkarbonátot különállóan sterilizáljuk, és a sterilizák 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
