190999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonint termelő törzsek előállítására

190 999

2

lást követően adjuk a táptalajhoz. A kalciumkarbonát hozzáadása után a táptalaj pH-értéke 6,8-7,2.

Az 1-3. számú táptalajokat tartalmazó lombikokat a fentebb felsorolt törzsek tenyészetével történő beoltás után forgó rázógépbe helyezzük (200 fordulat percenként), és 48 órán át inkubálunk 37 °C-on. A sejtek 95%-a a fermentálás után is megőrzik azt a képességüket, hogy treonin és izoleucin nélkül is növekedjenek. Az ampicillinnel szembeni ellenállóképességük plazmidok jelenlétét mutatja.

A törzsek által termelt treonin mennyiségét az 1. táblázatban adjuk meg.

Az L-treonin fermentorban történő előállítására a 2. példában ismertetett módon nyert Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7) törzsből készített oltóanyag 25 ml mennyiségét laboratóriumi fermentorba mérjük be. A fermentorba előzetesen beviszünk 250 ml 1. számú táptalajt. A fermentációs feltételek a következők : a hőmérséklet 37 °C, a készülékbe vezetett levegő mennyisége 1,1 (a rotamérő szerint), a keverő fordulatszáma 900/perc. A fermentálás kezdete után 28 órával megkezdjük az 1. számú táptalaj 10-szeres koncentrátumának beadagolását (térfogat: 250 ml). A koncentrátum azonban kalcium-karbonátot nem tartalmaz. Az adagolás 1,5 ml/óra sebességgel, perisztaltikus szivattyú segítségével történik. 51 órával a fermentálás kezdete után 20 g/1 mennyiségű treonin halmozódik fel a táptalajban. A sejtek a fermentálás után a pYN7 plazmidot tartalmazzák. A vizsgálati eredmények az 1. táblázatban láthatók.

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás L-treonint termelő törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli VNIIge-5 netika MG 442 donortörzs DNS-kromoszómájának Hind III endonukleáz enzimmel nyert, a treonin-operon génjeit tartalmazó töredékét DNS- vektormolekulaként pBR332 plazmiddal egyesítjük, ezáltal olyan hibridplazmidot kapunk, amely 10 a pBR 322 plazmidnak és a donortörzs DNS- kromoszóma megfelelő töredékének két másolatából áll, ezzel a hibridplazmiddal az L-treonin szintézisét blokkoló, az L-izoleucin szintézisét pedig részlegesen blokkoló mutációkkal rendelkező Es- 15 cherichia coli VL334 befogadó törzs sejtjeit transzformáljuk, és a kapott, L-treonint termelő Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6) törzset - amely B-1649 számon lett letétbe helyezve a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmus kivá- 2C lasztó Tudományos Kutatóintézetéhez tartozó Központi Ipari Mikroorganizmus Múzeumban - elkülönítjük.

2. Eljárás L-treonint termelő törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli VNIIgenetika MG442 donortörzs DNS-kromoszómájának Hind III endonukleáz enzimmel nyert, a treonin-operon génjeit tartalmazó töredékekét DNS vektormolekulaként pBR322 plazmiddal egyesítjük, a kapott, 11,2 megadalton molekulasúlyú, a

3C pBR322 plazmid két másolatából és a donortörzs DNS-kromoszómatöredékéből álló hibridplazmidot Hind III és Bam Hl specifikus endonukleáz

I. táblázat

Törzs

A törzs

Fermentációs

Termelt

sejtjeiben lévő

táptalaj

treoninplazmid típusa

sorszáma

mennyiség g/1

Escherichia coli VNII-1

3,0

genetika MG442

nincs plazmid

2

'l

3,3

Escherichia coli VNIIJ

1

7,0

genetika VL334 (pYN6)

plazmid pYN6

2

11,2

3

14,4

Escherichia coli VNII-1

20,0*

genetika VL334 (pYN7)

plazmid pYN7

2

13,3

3

16,5

* Táptalaj-adagolással ellátott fermentorban.

Az L-treonint önmagában ismert módon különítjük el a táptalajtól.

Amint a táblázat adataiból kitűnik, az aminosavat azok a törzsek termelik a legnagyobb mennyiségben, amelyek hibridplazmidot tartalmaznak.

enzimekkel kezeljük, a képződött töredékeket polinukleotidligáz enzimmel kezelve újra egyesítjük, és a kapott, 5,7 megadalton molekulasúlyú, a pBR322 plazmid egy molekulájából és a donortörzs DNS- 5’’ kromoszómatöredékéből álló hibridplazmiddal transzformáljuk az L-treonin szintézisét blokkoló, az L-izoleucin szintézisét pedig részlegesen blokkoló mutációkkal rendelkező Escherichia coli VL334 befogadó törzs sejtjeit, és a kapott, L-treonint ter- 60 melő Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7) törzset, - amely B-1684 számon lett letétbe helyezve a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmus kiválasztó Tudományos Kutatóintézetéhez tartozó Központi Ipari Mikroorganizmus Múze- 65 umban - elkülönítjük.

8

3 oldal rajz