190999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonint termelő törzsek előállítására
1 190 999 2 átalakulását részlegesen blokkolja - képes arra, hogy izoleucin távollétében nagy treonin-koncentrációjú táptalajon növekedjen. Nyilvánvaló, hogy az izoleucin nélküli táptalajon való növekedésre azok a hibridplazmidot tartalmazó sejtek is képesek, amelyek jelentős mennyiségű treonint tudnak szintetizálni. Valóban, miután a VL334 törzset a treonin-operon mindhárom génjét hordozó hibridplazmidokkal transzformáltuk, a sejtek képesek lesznek arra, hogy további növekedési faktorokat nem tartalmazó, glukózból és ásványi anyagokból álló táptalajon is növekedjenek. A teljes treonin-operont hordozó hibridplazmidokat tartalmazó sejtek - abban az esetben, ha a körülmények nem szelektívek - könnyen élveszítik a hibridplazmidot, és kihasad a befogadó kiindulási törzs, amely a treonint és az izoleucint tekintve auxotróf. Ha a növekedés ásványi anyagú, pótlólagos növekedési faktorokat nem tartalmazó táptalajon történik, a hibridplazmidot hordozó sejtek szelektív módon előnyben részesülnek azokhoz a sejtekhez képest, amelyek a plazmidot elveszhették. Ilyen körülmények között jelentős mennyiségű treonint szintetizálnak, amely a táptalajon kiválik. A táptalajon feldúsuló treonin elősegítheti azoknak a sejteknek a növekedését, amelyek a hibridplazmidot elveszítették. Csak 10-15 g/1 közötti treonin-koncentrációnál közeliti meg a VL334 törzs plazmidmentes sejtjeinek növekedési sebessége az olyan, hibridplazmidot hordozó sejtekét, amelyek az Escherichia coli VNIIgenetika MG442 donortörzstől származó teljes treonin-operont tartalmaznak. így az a mutáció, amely részlegesen blokkolja az illető aminosav metabolizmusának szomszédos szakaszát, biztosítja az aminosavszintézist fermentációs körülmények között szabályozó géneket hordozó hibridplazmidokat tartalmazó sejtek fejlődését. Az aminosavakat termelő törzsek előállítására irányuló találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy genetikai módszerekkel, a kívánt aminosav bioszintéziséhez szükséges gének dózisának megnövelésével olyan törzsekhez jussunk, amelyek pótlólagos növekedési faktorokat nem igényelnek, és megnövelt mértékben képesek a kívánt aminosav termelésére. A találmány szerinti eljárást az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük. 1 1. példa Donortörzsként az Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzset alkalmazzuk. A törzs ellenálló a treoninnal analóg beta-hidroxi-norvalinnal szemben, és olyan mutációt tartalmaz a thrA génben, amely zavarja a homoszerindehidrogenáz I enzim - ez kulcsenzim a treonin bioszintézisénél - aktivitásának treonin hatására fellépő alloszterikus gátlását. DNS-vektormolekulaként a pBR322 plazmidot alkalmazzuk. Ez a plazmid a CoIEI replikonon alapul, és olyan géneket tartalmaz, amelyek ellenállóvá teszik ampicillinnel, penicillinnel (Apr) és tetraciklinnel (Ter) szemben. A donortörzsként alkalmazott Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzs DNS-kromoszómájának töredékét és a pBR322 plazmidot önmagában ismert módon választjuk el. Hibridplazmidok létrehozása céljából a donortörzs DNS-kromoszómájának töredékét és a pBR322 plazmidot 1,5 órán át kezeljük 37 °C-on Hind III endonukleázzal, 10 percig melegítjük 65°C-on, és 18 óra alatt 6°C-on újraegyesítjük az enzimet a T4 fágok polinukleotidligázával. Az így nyert eleggyel transzformáljuk a C600 thr~leu~ törzs sejtjeit. A transzformánsokat 500 mikrogramm/ml penicillint és 50 mikrogramm/ml leucint tartalmazó táptalajon választjuk ki. Kétféle fenő típusba tartozó baktériumokat kapunk (ApTcsThr+Leu~ és ApTcThr+Leu~). A kromoszómán kívüli DNS elválasztásához és analíziséhez önkényesen az egyes fenotípusokba tartozó transzformált termékek egy-egy kiónját választjuk ki. Az ApTcThr+Leu- fenotípusba tartozó transzformánsokból a pYNIO hibridplazmidot különítjük el, amely a pBR322 plazmid töredékét tartalmazza, továbbá a donor 5,8 megadalton molekulasúlyú kromoszómatöredékét különítjük el. A hibridplazmiddal transzformáljuk a treoninoperon különböző génjeiben mutációkat hordozó Estherichia coli törzseket, abból a célból, hogy megvizsgáljuk a treonin-operon mindhárom génjének a jelenlétét és működését. A treonin-operon alábbi génjeiben fennálló mutációkat tartalmazó Escherichia coli törzseket transzformáljuk a hibridplazmiddal: Gtl4 (thrA,-), Gif 102 (thrA^), Gt25 (thrB“), VL334 (thrCT). Mindegyik esetben a treoninnak megfelelően prototróf transzformált baktériumtörzseket kapunk, és ez arra mutat, hogy a plazmidban a treonin-operon mindhárom génje (thrA, thrB és thrC) jelen van. A kromoszóma-DNS töredékének beépülése a HindlU endonukleáz enzimmel felhasított pBR322 plazmidba azzal a következménnyel jár, hogy inaktiválódnak a tetraciklinnel szembeni ellenállóképességet meghatározó plazmidgének, mivel az endonukleáz hatására bekövetkező elhasadási szakasz e gének promotorában helyezkedik el, amint az a 4. ábrán látható. A másik fenotípusba (ApTcThr+Leu~) tartozó baktériumokból 11,4 megadalton molekulasúlyú plazmidot különítünk el. Ennek a pYN6 jelzésű plazmidnak a restrikciós analízise azt az eredményt szolgáltatta, hogy a plazmid a DNS-kromoszóma Hind III töredékéből (5,8 megadalton molekulasúlyú) és a pBR322 plazmid két másolatából - ezek „fej-láb” típus szerint kapcsolódnak össze - áll, amint az a 4. ábrán látható. A 4. ábra a pYN7 plazmid restrikciós rajzát szemlélteti. A szaggatott vonallal kihúzott körív azokat a plazmidtöredékeket jelképezi, amelyekből a pYN7 plazmid felépül. A többi jelölés azonos az 1. ábrán alkalmazottal. A pBR322 plazmidnak a Hind III endonukleázza.l történő felhasítása a promotor széttörését eredményezi azoknál a géneknél, amelyek a tetraciklinnel szembeni ellenálló képességet határozzák meg. A képződött töredékeknek a két lehetséges orientáció valamelyike szerinti összekapcsolása pontosan helyreállítja a promotor szerkezetét, és biztosítja t, 10 15 20 25 30 30 40 40 5C 55 60 65 6
