190999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonint termelő törzsek előállítására
1 190 999 _ 2 2. Green P. J., Betlach M. C., Boyer H. W., Goodman H. N., Methods in Molecular Biology, 7, 87 (1974); 3. Tanaka T., Weisblum B., J. Bacteriol., 121, 354 (1975); 4. Clarke L., Carbon J., Proc. Nat. Acad. Sei. U. S. A., 72, 4361 (1975); 5. Bolivar F., Rodrigues R. L., Green PI. J., Betlach M. C., Heyneker H. L., Boyer H. W., Gene, 2, 95 (1977): 6. Kozlov J. I., Kalinina N. A., Gening L. V., Rebentish B. A., Strongin A. J., Bogush V. G., DebanovV. G., Molec. Gen. Genetics, 150, 211 (1977). Â genetikai kutatási módszerek gyakorlati alkalmazása a Pseudomonas törzsek előállítására kifejlesztett eljárás lett. Ezek a törzsek a kőolajban jelenlevő szénhidrogéneket bontják el [3 923 603 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Ez utóbbi ismert eljárásnál a hibridmolekulákat in vivo állították elő sejtközi rekombinációval. Ennek ellenére mindeddig nem váltak ismertté olyan módszerek, amelyekkel aminosavakat termelő törzsek lennének előállíthatok genetikai módszerekkel. A találmány célja a genetikai módszerek alkalmazása a kívánt aminosav bioszintéziséhez szükséges gének dózisának megnövelésére, annak érdekében, hogy az aminosavak termelésére nagyobb mértékben képes törzseket kapjunk. A kitűzött célt a találmány szerint úgy érjük el, hogy az aminosavakat termelő törzsek előállításához a kiválasztott aminosav szintézisét szabályozó géneket tartalmazó és a szóban forgó aminosav szintézisének negatív regulációját zavaró mutációjú donor organizmus DNS-kromoszómájának egy töredékét DNS-vektormolekulával DNS-hibridmolekulává egyesítjük. Az eljáráshoz olyan DNS- vektormolekulát alkalmazunk, amely képes a DNS-hibridmolekula amplifikációjára. Az így kapott DNS-hibridmolekulával a befogadó törzs sejtjeit transzformáljuk. A befogadó törzs eredeti mutációja olyan, hogy blokkolja a szóban forgó aminosav szintézisét ennél a törzsnél és részben blokkolja az aminosav metabolizmusának szomszédos szakaszát. A transzformáció után ilyen módon olyan törzshöz jutunk, amely megnövelt mértékben képes a kiválasztott aminosav termelésére. A genetikai ballasztanyag eltávolítására - annak érdekében, hogy megnöveljük a hibridplazmid stabilitását és másolatainak számát a sejtben - a kapott DNS-hibridmolekulát célszerűen a befogadó törzs sejtjeinek transzformációja előtt olyan endonukleázokkal kezeljük, amelyek elhasítják a DNS- hibridmolekulát a molekula előzetesen meghatározott pontjain, majd a szükséges DNS-töredékeket polinukleotidlígáz enzimmel történő kezeléssel újra egyesítjük. A találmány szerint úgy állítunk elő aminosavakat, például L-treonint termelő törzset, hogy az Escherichia coli VNIIgenetika MG 442 donortörzs DNS-kromoszómájának Hind III endonukleáz enzim segítségével nyert részletét - amely treoninoperon géneket tartalmaz, és amelynél az enzim mutációja folytán a thrA gén termékei ellenállnak a treoninnal való gátlással szemben - DNS-vektormolekulával egyesítjük. DNS-vektormolekulaként pBR 322 plazmidot alkalmazunk. Ilyen módon hibridplazmidot kapunk, amelynçk a molekulasúlya 11,2 megadalton, s a pBR 322 plazmid, valamint a donortörzs DNS-kromoszómájából előállított töredék két másolatából áll. A hibridplazmid ellenállóvá teszi a sejteket penicillinnel és tetraciklinnel szemben, s a logaritmusos növekedési szakaszban a sejtekben körülbelül 10 másolata lehet jelen. A kapott hibridplazmidot transzformáljuk a befogadó törzs sejtjeibe. Befogadó törzsként Escherichia coli VL334-t alkalmazunk, amely olyan mutációjú, hogy blokkolja az L-treonin és az L- izoieucin szintézisét, ahol az izoleucin szintézisének blokkolása részleges, és a sejtben megnövelt treonintartalommal ellensúlyozható. E mutációk szelektív módon előnyt adnak a hibridplazmidot tartalmazó sejteknek azokkal a sejtekkel szemben, amelyekben a tenyésztés során a plazmid elveszett. Ilyen módon L-treonint termelő Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pyN6) törzset kapunk. Ez a törzs B-1649 számon lett letétbe helyezve a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmuskiválasztó Tudományos Kutatóintézetéhez tartozó Központi Ipari Mikroorganizmus Múzeumban. A VNIIgenetika kifejezés a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmuskiválasztó Tudományos Kutatóintézetének rövidítése. Az L-treonint termelő törzs előállítására szolgáló találmány szerinti eljárás egy másik változata szerint az Escherichia coli VNIIgenetika MG 442 donor örzs DNS-kromoszómájának Hind l\l endonukleáz enzim segítségével nyert részletét - amely treoninoperon géneket tartalmaz, és amelynél az enzim mutációja folytán a thrA gén termékei ellenállnak a treoninnal való gátlással szemben - DNS-vektormolekulával egyesítjük. DNS-vektormolekulaként pBR 322 plazmidot alkalmazunk. Ilye i módon hibridplazmidot kapunk, amelynek a molekulasúlya 11,2 megadalton, s a pBR 322 plazmid valamint a donortörzs DNS-kromoszómájából előállítót töredék két másolatából áll. A kapott hibridplazmidot Hind Ul és Ram Hl endonukleázokkal kezeljük, és a képződő töredékeket polinuleotidligáz enzimmel történő kezelés útján újraegyesítjük. Ekkor a képződött hibridplazmid 5,7 megadalton molekulasúlyú, a pBR 322 plazmid molekulájából és a DN^-kromoszóma emlitett töredékéből áll, ellenállóvá teszi' a sejteket penicillinnel szemben, s a logaritrnusos növekedési szakaszban a sejtekben körülbelül 20 másolata lehet jelen. Az így kapott hibridplazmiddal módosítjuk a befogadó Escherichia coli VL334 törzs sejtjeit. E törzs olya n mutációjú, hogy blokkolja az L-treonin és az L-izoleucin szintézisét, ahol az izoleucin szintézisének blokkolása részleges, és a sejt megnövelt treonintartalmával ellensúlyozható. E mutációk szelektív módon előnyt adnak a hibridplazmidot tartalmazó sejteknek. Ilyen módon L-treonint termelő Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7) törzset kapunk. Ez a törzs B-1684 számon lett letétbe helyezve a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmuskiválasztó Tudományos Kutatóintézetéhez tartozó Központi Ipari Mikroorganizmus Múzeumban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
