190999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonint termelő törzsek előállítására
1 190 999 2 A találmány szerinti eljárás során az alábbiakban ismertetett módon járunk eT!;~ Egy meghatározott aminosavat termelő törzs előállításához olyan mikroorganizmus donortörzset választunk ki, amelynek a DNS-kromoszómatöredéke a szóban forgó aminosav szintézisét szabályozó géneket tartalmaz. A donortörzset olyan mutációk jellemzik a klónozni kívánt génekben vagy az ezekkel a génekkel szomszédos szabályozó tartományban, amelyek zavarják az aminosavszintézis negatív szabályozását. Az ilyen jellegű mutációk fokozzák az aminosavszintézist, és önmagában ismert módon biztosíthatók. Olyan DNS-vektormolekulát, például egy plazmidot választunk ki, amely biztosítja a beépült, genetikailag idegen anyag replikációját, és meghatároz egy vagy több megkülönböztető jellemzőt, például az antibiotikumokkal szembeni ellenállóképességet. A hibridmolekulák képzéséhez, azaz a donortörzs DNS- kromoszóma-töredékének és a DNS-vektormolekulának az egyesítéséhez DNS-kromoszóma töredékeket hozunk létre specifikus endonukleáz segítségével vagy valamilyen más módon, majd a kapott elegyet polinukleotidligázzal kezeljük. Ez az enzim véletlenszerű módon újraegyesíti a töredékeket. A kapott elegyet felhasználjuk a baktériumok genetikai transzformációjához. A hibridplazmidoknál olyan DNS-kromoszóma töredékeket választunk ki, amelyek az illető aminosav szintézisét szabályozó géneket hordozzák. A transzformáció során befogadó törzsként olyan baktériumtörzset alkalmazunk, amelynél az adott aminosav szintézisét szabályozó gének közül legalább egy sérült, és a törzs a szóban forgó aminosavat tekintve auxotróf. A transzformáció után olyan prototróf transzformánsokat választunk ki, amelyek egyidejűleg a vektorplazmid által meghatározott szelektív jellemzőket hordozzák. Ezek a transzformánsok több fenotípust is képezhetnek. Az egyes fenotípusba tartozó transzformánsokból önmagában ismert módon elválasztjuk a hibridplazmidokat. Ezek a hibridplazmidok a donortörzs DNS-kromoszómájának különböző méretű töredékeit hordozhatják, és a vektormolekula különböző számú másolatait tartalmazhatják. Megvizsgáljuk, hogy az elválasztott hibridplazmidokban megtalálhatók-e a donortörzs kromoszómájának olyan töredékei, amelyek az illető aminosav szintézisét szabályozó géneket tartalmaznak. Ehhez a hibridplazmidokkal olyan auxotróf törzseket transzformálunk, amelyek a klónozni kívánt géneknek megfelelő mutációkkal rendelkeznek. A transzformánsok prototrófiájának ismételt kialakulása ebben az esetben az illető gén hibridplazmidjának jelenlétére mutat. A kívánt aminosavat termelő törzsek létrehozására irányuló további munka során olyan hibridplazmidokat alkalmazunk, amelyek valamennyi kiválasztott, az aminosav szintézisét szabályozó gént tartalmazzák. Abban az esetben, ha az elkülönített plazmidok nem tartalmazzák az összes szükséges gént, megismételjük a fentebb ismertetett műveleteket, megváltoztatjuk azonban a DNS-töredékek előállításmódját, például egy másik specifikus endonukleáz alkalmazásával. A genetikai ballasztanyag eltávolítása, a hibridplazmid stabilitásának növelése és a sejtben jelenlevő hibridplazmid-másolatok számának növelése érdekében a kapott hibridplazmidot a befogadó törzs transzformációja előtt célszerűen specifikus endonukleázokkal kezeljük, amelyek felhasítják a molekulát az előre meghatározott pontokon, majd a szükséges töredékeket polinukleotidligáz enzimmel való kezeléssel újraegyesítjük. A kapott hibridplazmidot, amely valamennyi, az aminosav szintézisét a szóban forgó mikroorganizmusnál szabályozó, kiválasztott gént tartalmaz, felhasználjuk a befogadó törzs sejtjeinek genetikai transzformációjához. A transzformáció után ez a törzs magasabb szinten képes a szóban forgó aminosav termelésére. A befogadó törzs mutációja olyan, hogy az blokkolja a szóban forgó aminosav szintézisét ennél a törzsnél. Ezáltal lehetőség nyílik arra, hogy könnyen kiválaszthassuk azokat a transzformált törzseket, amelyek az aminosav szintézisét szabályozó géneket tartalmazó hibridplazmidot hordozzák. Ezen túlmenően a befogadó törzsnek olyan mutációval kell rendelkeznie, amely részlegesen blokkolja a kérdéses aminosav metabolizmusának szomszédos szakaszát. Az aminosav metabolizmusánál a szomszédos szakasz, például a következő szakasz részleges blokkolása azzal a következménnyel jár, hogy nagy koncentrációban van szükség erre az aminosavra annak a metabolitnak a szintéziséhez, amelynek elővegyülete a szóban forgó aminosav. Ennek következtében előtérbe kerülnek az olyan hibridplazmidokat tartalmazó befogadó sejtek, amelyek képesek az illető aminosav jelentős mennyiségének a szintetizálására, mivel ezek az aminosav és a metabolit - e metabolit elővegyülete az illető aminosav - távollétében is képesek a táptalajon növekedni. Ugyanakkor háttérbe szorulnak a plazmidokat nem tartalmazó sejtek. Célszerűen a befogadó törzs olyan mutációval is rendelkezik, amely zavarja a megfelelő gének represszióját. Előnyös az olyan mutációk jelenléte is, amelyek blokkolják az illető aminosav katabolizmusát és átalakulásait. A találmány szerinti eljárással előállított törzseket különböző aminosavak, például a treonin termelésére alkalmazzuk. Ehhez a törzseket asszimilálható szénforrásokat, ásványi anyagokban jelenlévő nitrogént és ásványi sókat tartalmazó táptalajon fermentáljuk, ahol a táptalaj célszerűen annak a sejtpopulációnak a fejlődését biztosítja, amely a hibridplazmidot hordozza. Kísérleteket végeztünk az Escherichia coli K12 törzs sejtjeiben a treonin-operon génjeinek klónozására, és a kísérleti eredmények a találmány szerinti eljárás helyességét igazolják. Kísérleteinket a következőképpen végeztük : . Donortörzsként az Escherichia coli W3350 törzset alkalmaztuk, amely vad típushoz tartozó treonin-operont hordoz. A DNS-vektormolekula a pBR 322 plazmid volt. A DNS-töredékek előállításához EcoRI restrikciós endonukleáz enzimet használunk, és így pEKI hibridplazmidot kaptunk. A plazmidot ezután Hindin endonukleáz enzimmel és polinukleotidligáz enzimmel kezeltük, és ily 5 10 15 20 25 30 35 4C 45 5C 55 6C 65 4
