190973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF-analógok előállítására
1 190 973 . 2 Lubke [„The Peptides” 1, 72-75 (Academic Press 1965)] által leírt standard hasító reagenseket és körülményeket is használhatunk. A leucin alfa-amino védőcsportjának eltávolítása után a többi az alfa-amino-csoporton és az oldatláncban védett aminosavakat lépésenként a kívánt sorrendben kapcsoljuk össze, így a fent leírt közbenső terméket kapjuk, vagy az egyes aminosavakat lépésenként kapcsoló eljárástól eltérő változat szerint, a szilárd fázisú reaktorhoz való adás előtt, néhány aminosavat összekapcsolunk. A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása a szakmai tapasztalatoktól függ. Kapcsoló reagensként különösen jól használható az N,N'-diciklohexil-karbodiimid (DCCI). A peptidek szilárd-fázisú szintézisében használt aktiváló reagensek jól ismertek a peptid-kémiában. Megfelelő aktiváló reagensek lehetnek : 1. A karbodiimidek, például az N,N'-diizopropil-karbodiimid és N,N'-diciklohexil-karbodiimid (DCCI); 2. A ciánamidok, például az N,N'-dibenzil-ciánamid; 3. Ketiminek; 4. Az izoxazólium-sók, például az N-etil-5-fenilizoxazólium-3'-szulfonát; 5. A gyűrűben 1-4 nitrogénatomot tartalmazó, aromás jellegű, monociklusos nitrogén-tartalmú heterociklusos amidok, például imidazolidok, pirazolidok és 1,2,4-triazolidok. A használható, specifikus heterociklusos amidok közé tartozik például az N,N'-karbonil-diimidazol és az N,N'-karbonil-di-1,2,4-triazol ; 6. Az alkoxilezett acetilén, például etoxi-acetilén; 7. Az aminosav karboxil-részével vegyes anhidridet képező reagensek, például a klórhangyasavetilészter és klórhangyasav-izobutilészter, és 8. Az aminosav-karboxil-részével aktív észtert képező reagensek, például a gyűrű-nitrogénen hidroxicsoportot tartalmazó nitrogén-tartalmú heterociklusos vegyületek, úgymint az N-hidroxi-ftálimid, N-hidroxi-szukcinimid és 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT). A peptid-kapcsolásban használt egyéb aktiváló reagenseket és használatukat Schroder & Lubke (supra. III. fejezet) és Kapoor [7. Phar. Sei., 59, 1-27 (1970)] írják le. Minden egyes védett aminosavat, vagy peptidszakaszt körülbelül kétszeres feleslegben juttatunk a szilárd fázisú reaktorba, és a kapcsolást dimetilformamid (DMF) : diklórmetán 1 : 1 arányú elegyében, illetve tiszta dimetilformamidban vagy diklórmetánban hajtjuk végre. Azokban az esetekben, mikor a kapcsolás nem tökéletes, a kapcsolási eljárást megismételjük az alfa-amino védőcsoport eltávolítása előtt, mielőtt a következő aminosavat kapcsolnánk. A szintézis minden szakaszában a kapcsolási reakció sikerességét a ninhidrin reakcióval követjük, amint azt E. Kaiser és munkatársai [Anal. Biochem., 34, 595 (1970)] közölték. Miután a kívánt aminosav-sorrendet létrehoztuk, közbenső termék peptidet eltávolítjuk a gyanta-hordozóról egy reagenssel, például folyékony hidrogén-fluoriddal kezelve, mely nemcsak lehasítja a peptidet a gyantáról, hanem eltávolítja az öszszes X2, X3, X4, X5, X6, X7 és X8 oldallánc védőcsoportot, és az X, alfa-amino védőcsoportot is, így megkapjuk a peptidet. Egy másik módszer szerint a peptid közbenső terméket alkoholízissel távolíthatjuk el a gyantahordozóról, majd a kinyert C-terminális alkilésztert hidrolízissel savvá alakítjuk. Bármelyik oldallánc védőcsoportot lehasíthatjuk az előzőekben közölt módszerekkel, vagy más ismert eljárással, például katalitikus redukcióval, például báriumszulfát palládiummal. Ha hidrogén-fluoridot használunk a hasításra, semlegesítés céljára anizolt és metil-etil-ketont teszünk a reakció-elegybe. A következő példákban a GRF szilárd-fázisú technikával történő előnyös szintéziseit mutatjuk be. 1. példa A H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser- Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg- Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg- Val-Arg-Leu-OH képletü pGRF (1-44) szabad savat lépésenként szintetizáljuk Beckman 990 Peptid Szintetizátorral olyan klór-metilezett gyantán, mely a Láb. Systems, Ins. termék és 0,9 Meq/g klórt tartalmaz. A BOC-Leu csoportnak a gyantához kapcsolását a Monahan és mtsai [Biopolymers, 12, 2513-2519 (1973)] által közölt általános módszerrel végezzük, melynek eredményeként körülbelül 0,22 millimól leucin kötődik egy gramm gyantához. Az összes használt oldószert gondosan gáztalanítjuk semlegesgáz, előnyösen hélium átbuborékoltatásával, ezzel biztosítjuk, hogy ne legyen a metionin kénatomját előnytelenül oxidáló oxigén a rendszerben. A védöcsoport eltávolítása és semlegesítés után a peptid-láncot lépésről lépésre építhetjük fel a gyantán. A védőcsoport eltávolítása, a semlegesítés és az egyes aminosavak hozzáadása lényegében a Guillemin és munkatársai (3 904 594 számú amerikai egyesült államokbeli találmány) által közölt eljárással történik. A kapcsolásokat a következő, A ütemterv szerint végezzük : ÜTEMTERV Lépés Reagensek és műveletek Keverési idő, perc 1 Diklórmetános mosás (kétszer) 0,5 2 50% trifluor-ecetsav (TFA) + 5% 1,2-etánditiol diklórmetánban (egyszer) 0,5 3 50% trifluor-ecetsav (TFA) + 5% 1,2-etán-ditiol di-klór-metánban (egyszer) 20,0 4 Diklórmetános mosás (háromszor) 0,5 5 Metanolos mosás (kétszer) 0,5 6 10% trietilamin diklórmetánban semlegesítés (kétszer) 0,5 7 Metanolos mosás (kétszer) 0,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 55 4
