190973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF-analógok előállítására
1 190 973 2 Lépés Reagensek és műveletek Keverési idő, perc 8 10% tríetilamin diklórmetánban semlegesítés (kétszer) 0,5 9 Metanolos mosás (kétszer) 0,5 10 Diklórmetános mosás (kétszer) 0,5 11 *Boc-aminosav (1 mmól/g gyanta) plusz ekvivalens mennyiségű diciklohexil-karbodiimid (DCC) hozzáadás diklórmetánban 120 12 Diklórmetános mosás (kétszer) 0,5 13 50% dimetilformamid diklórmetánban mosás (kétszer) 0,5 14 10% trietilamin (Et3N) diklórmetánban mosás (egyszer) 0,5 15 Metanolos mosás (kétszer) 0,5 16 Diklórmetános mosás (kétszer) 0,5 17 25% ecetsav-anhidrid diklórmetánban (2 ml/g gyanta) 20,0 18 Diklórmetános mosás (kétszer) 0,5 19 Metanolos mosás (kétszer) 0,5 * Asn és Glu kapcsolása esetén 1,136 mólfeleslegben 1-hidroxi-benzotriazolt (HOBt) használunk. Röviden, a kapcsolási reakcióban 1 mmól BOC- val védett aminosav diklórmetános oldatát használjuk egy gramm gyantára számítva, plusz egy mól ekvivalens 0,5 mólos DCCI-t diklórmetánban vagy 30% dimetilformamid diklórmetános oldatában, két órán át. Ha arginint kapcsolunk, 10% dimetilformamid diklórmetános oldatát használjuk. Szerin és treonin kapcsolásánál Bzl-t használunk az oldalláncban levő hidroxil-csoport megvédésére. 2- klór-benziloxi-karbonil-csoportot (2C1—Z) használunk a lizin oldalláncának megvédésére. Tos-t használunk az arginin guanidin-csoportjának megvédésére, a glutaminsav és aszparaginsav karboxilcsoportját Bzl-észter formájában védjük meg. A tirozin fenolos hidroxil-csoportját 2,6-diklórbenzil-csoporttal védjük. A szintézis végén a következő általános képletű vegyületet kapjuk : X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu- Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(Xö)-Lys(X7)-Leu- Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X5)-Arg(X6)-Gln- Gln-Gly-Glu(X3)-Arg(X®)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln- Gly-Ala-Arg(X6)-Val-Arg(X6)-Leu-X8, ahol X, jelentése BOC-csoport, X2 jelentése 2,6-diklórbenzil-csoport, X3 jelentése benzil-éter, X4 jelentése Bzl-csoport, Xj jelentése Bzl-csoport, Xö jelentése Tos-csoport, X7 jelentése 2—Cl—Z csoport és X8 jelentése —O—CH2-benzol-polisztirol gyanta. Miután az utolsó tirozin-csoportot is hozzákapcsoltuk a gyantához, a BOC-csoportot 45%-os TFA diklórmetános oldatával távolítjuk el. A viszszamaradó védett peptid-gyanta komplexről a védőcsoportok eltávolítására 1,5 ml anzilot, 0,25 ml metil-etil-szulfidot és 10 ml hidrogén-fluoridot adunk egy gramm peptid-gyanta komplexre számítva a keverékhez és fél órán át - 20 °C-on, majd fél órán át 0 °C-on tartjuk. Miután a hidrogén-fluoridot nagy vákuumban eltávolítottuk, a gyantapeptid maradékot váltakozva mossuk száraz dietiléterrel és kloroformmal, majd a pepiidet gázmentesített 2 n vizes ecetsavval extraháljuk. Az ecetsavas extraktum liofilezésével fehér, pelyhes anyagot kapunk, gyakorlatilag kvantitatív kitermeléssel. A lehasított és védőcsoport-mentesített pepiidet ezután 30%-os ecetsavban oldjuk és Sephadex G-50 oszlopon gélszűrjük. Ezután a pepiidet tovább tisztítjuk CM-32 karboxi-metilcellulóz (Whatman) kationcserélő kromatográfiával (1,8x18 cm, ágytérfogat = 50 ml) konkáv gradienst alkalmazva, melyet úgy állítunk elő, hogy 1 1 0,4 mólos ammónium-acetát-oldatot (pH = 6,5) 400 ml 0,01 mólos ammónium-acetátoldatot (pH = 4,5) tartalmazó keverőlombikba csepegtetünk. A végső tisztítást megoszlási kromatográfiával végezzük Sephadex G-50 (finom) hordozón (Pharmacia) n-butanol : etanol : piridin : 0,2% 1 n ecetsav (4 : 1 : 1 : 7 arányú) oldószer-rendszerrel. A tisztítás részleteit Ling és munkatársai [Biochem. Biophys. Res. Commun., 95, 945 (1980)] közük. A kromatográfiás frakciókat gondosan yizsgáljuk vékonyréteg-kromatográfiával, és csak a lényegében tiszta frakciókat egyesítjük. A pGRF (1-44) szabad sav optikai forgatóképessége [a]D = -66,2 ±1° (c = 1,1%-os ecetsavban), a pGRF—NH2 (1-44) [a]D-értéke: -64,2° ±V (c = 1,1%-os ecetsavban). A szintézist megismételjük, MBHA gyanta felhasználásával, amidált C-terminálist hordozó azonos peptid előállítására, a leucinnak MBHA gyantához kötésére használt 4 292 313 számú amerikai szabadalmi leírásban közölt eljárást követve. 2. példa A pepiidnek a növekedési hormon kibocsátásának meggyorsítását elősegítő hatásának meghatározására in vitro vizsgálatokat végeztünk szintetikus hGRF(l-44)—NHj-t közvetlenül összehasonlítva pGRF(l-44)—NH2-vel és a hipofézis sejtekből a növekedési hormon felszabadítására ismert aktivitással rendelkező GRF Referencia Standarddal. A GRF Referencia Standard leírását Brazeau és munkatársai adják meg [Endocrinology 110, A 538 (1982)], és olyan mennyiségű patkány hipotalamusz-eredetü készítményt jelent, mely hipofízis egyrétegű tenyészetben a GH kibocsátás szempontjából a maximális válasz felét idézi elő. Olyan tenyészeteket használnak, melyekben négy-öt nappal korábban patkány hipofízisből eltávolitott sejtek vannak. Mind a meghatározott standard táptalajon nőtt tenyészetet, mind a növekedési hormon kiválasztása szempontjából optimálisnak tekintett tenyészeteket használnak az összehasonlító vizsgálatok céljára a Brazneau és munkatársai [Regulatory Peptides, l, 255 (1981)] által leírt általános módszerrel. A tenyészetet 3-4 óráig inkubáljuk a vizs5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
