190973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF-analógok előállítására
1 190 973 2 Asn-Ser(X!)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-R13-Leu-GIy-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X6)-Lys-(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-R28(X5)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly-Ala-R41(X® vagy X7)-Val-Arg(X6)Leu-X8 (II). A képletben Xj jelentése vagy hidrogénatom, vagy alfa-amino-védőcsoport. Az Xj-gyel szemléltetett alfa-amino-védőcsoportok ismertek a polipeptidek lépésenkénti szintézisében. Az X,-gyel jelzett alfa-amino-védőcsoportok a következő osztályokba tartoznak : 1. acil-tipusú védőcsoportok, pl. a formil-, trifluor-acetil-, ftalil-, toluol-szulfonil (Tos)-, benzolszulfonil-, nitrofenil-szulfenil-, tritilszulfenil-, onitro-fenoxiacetil-, klóracetil-, acetil- és gammaklór-butiril-csoport ; 2. aromás uretán-tipusú védőcsoportok, például a benziloxi-karbonil(Z)-csoport és a helyettesített Z-csoport, például a p-klór-benziloxi-karbonil-, pnitro-benziloxi-karbonil-, p-bróm-benziloxikarbonil- és p-metoxi-benziloxi-karbonil-csoport; 3. alifás uretán védőcsoportok, például a tercbutiloxi-karbonil(BOC)-, diizopropil-metiloxikarbonil-, izopropiloxi-karbonil-, etoxi-karbonil- és alliloxi-karbonil-csoport; 4. cikloalkil uretán-típusu védőcsoportok, például a ciklopentiloxi-karbonil-, adamantiloxikarbonil- és ciklohexiloxi-karbonil-csoport; 5. tiouretán-típusú védőcsoportok, például a fe-nil-tiokarbonil-csoport; ' 6. alkil-típusú védőcsoportok, például a trifenilmetil (tritil)-benzil-csoport; 7. trialkil-szilán-csoportok, például a trimetilszilán-csoport. Az előnyös tulajdonságú alfaamino-védőcsoport a BOC. X2 jelentése a Tyr fenolos hidroxil-csoportjának védőcsoportja, lehet tetrahidro-piranil-, ícrobutil-, tritil-, benzil-, (Bzl)-, benziloxi-karbonil-, CBZ-, (4- bróm-benzil)oxi-karbonil-, 4-Br-CBZ- és 2,6-diklór-benzil-csoport. Az előnyös tulajdonságú védőcsoport a 2,6-diklór-benzil-csoport. X2 lehet még hidrogénatom, ami azt jelenti, hogy nincs védőcsoport a hidroxil-csoporton. X3 jelentése hidrogénatom, vagy az Asp vagy Glu karboxil-csoportjaival észterkötést létrehozó védőcsoport, és lehet Bzl-, 2,6-diklór-benzil-, metil- és etil-csoport. X4 és X5 jelentése a Thr és Ser hidroxil-csoportjának védőcsoportjai, lehetnek acetil-, benzoil-, tercbutil-, tritil-, tetrahidropiranil-, Bzl-, 2,6-diklórbenzil- és CBZ-csoport. X4 és/vagy X5 lehet hidrogénatom, ami azt jelenti, hogy nincs védőcsoport a hidroxil-csoporton. X6 jelentése az Arg guanidino-csoportjának védőcsoportja, lehet nitro-, Tos-, CBZ-, adamantiloxi-karbonil- és BOC-csoport, vagy hidrogénatom. X7 jelentése hidrogénatom, vagy a Lys aminosav oldalláncán szereplő amin-csoport védőcsoportja. Megfelelő oldalláncban szereplő amino-csoport védőcsoport lehet a 2-klór-benziloxi-karbonil (2-C1- Z)-, Tos-, CBZ-, terc-amiloxi-karbonil- és BOC- csoport. Az oldalláncban szereplő amino-csoport védőcsoportjának megválasztása nem kritikus, kivéve hogy olyannak kell lennie, hogy a helyén maradjon, miközben a szintézis során eltávolítjuk az alfaamino-csoport védőcsoportját. Tehát az alfaamino-védőcsoport és az oldallánc-amino védőcsoport nem lehet azonos. Adott esetben a Gin és/vagy Asn aminosav oldalláncban lévő aminocsoportot megfelelően védhetjük xantil (Xan)-csoporttal. X8 jelentése lehet hidroxil-, metoxi-csoport, észterek, amidok, hidrozidok, —O—CH2-gyantaanyag és —NH—gyanta-anyag, általában védőcsoportként ismert hidroxi- és amid-csoportoktól eltérő csoportokkal. A közbenső termék általános képletében X,, X2, X3, X4, X5, X6, X7 és X8 közül legalább egy jelentése védőcsoport. A peptidek szintézisében használt oldalláncvédőcsoportok kiválasztásánál, a következő szabályokat kell követni: a) a védőcsoportnak stabilnak kell lennie a reagenssel szemben, valamint a szintézis minden egyes lépésében az alfa-amino-védőcsoport eltávolítására használt reakció-körülmények között, b) a védőcsoportnak meg kell tartania védő tulajdonságait és nem szabad lehasadnia a kapcsolás körülményei között, és c) az oldallánc védőcsoportnak eltávolíthatónak kell lennie, miután a szintézis befejezéseként kialakult a kívánt aminosav-sorrend, olyan körülmények között, amelyek nem változtatják meg a peptidláncot. A peptideket előnyösen szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, például a Merrifield [J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)] által leírt módszerrel, jóllehet más, a szakterületen ismert megfelelő kémiai szintézissel is előállíthatjuk, mint azt az előzőekben említettük. A szilárd-fázisú szintézis a peptid c-terminális végénél kezdődik, egy védett alfa-aminosavnak megfelelő gyantához kapcsolásával. A kiindulási anyag előállításánál az alfa-amino-csoporton védett leucint kapcsolunk észter-kötéssel klór-metilezett gyantához, vagy amid-kötéssel BHA vagy MBHA- típusú gyantához. A hidroxi-metil gyanta előállítását Bodánszki és mtsai [Chem. Ind. (London), 38, 1597-98 (1966)] írják le. Klór-metilezett gyanták kereskedelmi forgalomban vannak (Bio Rád Laboratories, Richmond, California és Lab. Systems, Inc.). Ilyen gyanta előállítását Stewart és mtsai [„Solid Phase Peptide Synthesis” (Freeman & Co., San Francisco 1969), 1. fejezet, 1-16] írják le. A BHA és MBHA gyanta-hordozók kereskedelmi forgalomban vannak, általában csak akkor használják, ha a szintetizálni kívánt peptidnek a C- terminális végén alfa-karboxamid található. A BOC-csoporttal védett leucint a klór-metilezett gyantához Monahan és Gilon [Biopolymer, 12, 2513-19 (1973)] módszerével kapcsoljuk, amihez például az szükséges, hogy a 44 aminosavból álló pepiidet szabad karboxil-véggel szintetizáljuk. A BOC-Leu kapcsolása után az alfa-amino védőcsoportot eltávolítjuk, trifluor-ecetsawal (TFA) diklórmetánban, csak TFA-val vagy sósavas dioxánnal. A védőcsoport eltávolítását 0 °C és szobahőmérséklet között végezzük. A specifikus alfaamino védőcsoport eltávolítására más Schroder & 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
