190973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF-analógok előállítására
1 190 973 2 A találmány tárgya szintetikus eljárás az emlősök hipofízisét befolyásoló peptidek előállítására. Pontosabban, a találmány tárgya eljárás olyan peptidek előállítására, melyek elősegítik a növekedési hormon felszabadulását a hipofízisből, és adott fajoknál különösen hatékonyak. 1982-ben humán szerv-daganatból a hipofízis növekedési hormon, vagy szomatotropin hipotalamuszos felszabadító faktorát izolálták, tisztították, jellemezték és szintetizálták. A vizsgálat során azt találták, hogy elősegíti a növekedési hormon (GH) felszabadulását a hipofízisből. Ennek a pepiidnek az aminosav-sorrendje a következő : H-T yr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-T yr- Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys- Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg- Leu-NHj. Úgy találták, hogy a humán hipotalamuszos növekedési hormont felszabadító faktor (hGRF) szerkezete ugyanaz, lásd [Bohlen et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm, 114, (3), 930-936 (1983)]. 44 aminosavból álló polipeptideket izoláltak sertés, szarvasmarha, kecske és juh hipotalamuszának tisztított hipotalamuszából, majd jellemezték. Mindegyikről úgy találták, hogy néhány aminosavban eltérnek a hGRF fent közölt képletétől. A hGRF összetételét véve alapul, a sertés GRF (pGRF)-et az [Arg34, Gin38, Val42]-hGRF (1^44)NH2 analógként írhatjuk le, melynek jelentése a következő képlet: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NH2. A fenti képletű vegyületre a továbbiakban mint pGRF-re vagy sertés szomatokrininre hivatkozunk. Ezt a pepiidet meleg vérű állatok, különösen sertések, azonkívül hideg vérű állatok, például halak növekedésének serkentésére használhatjuk. A hGRF összetételét véve alapul a szarvasmarha GRF (bGRF)-et az [Asn28, Arg34, Gin38, Lys41, Val42]-hGRF (l-44)-NH2 analógként írhatjuk le, melynek jelentése a következő képlet : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2. A fenti képletű vegyületre a továbbiakban mint bGRF-re vagy szarvasmarha szomatokrininre hivatkozunk. A kecske GRF-nek ugyanez a képlete, és meleg vérű állatok, különösen szarvasmarha, valamint hideg vérű állatok növekedésének elősegítésére használható, azonkívül a haltenyésztésben. Használható ezenkívül a teheneknél és kecskéknél a tejtermelés fokozására. A hGRF összetételét véve alapul, a juh GRF (oGRF)-et az [Ile13, Asn28, Arg34, Glu38 Lys41, Val42]-hGRF (l-44)-NH2 analógként írhatjuk le, melynek jelentése a következő képlet : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Leu-GIy-Gln-Leu-Ser-AIa-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gl i-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg- Leu-NH2. A fenti képletű vegyületre a továbbiakban mint az oGRF-re vagy juh szomatokrininre hivatkozunk. Ezt a pepiidet meleg vérű állatok, különösen juhok, valamint hideg vérű állatok, így halak növekedésének elősegítésére használhatjuk. Használható ezenkívül anyajuhoknál a tejtermelés fokozására is. A peptidek meghatározására használt nómenklatúra a Schroder és Lubke által leírt [„The Peptides”, Academic Press (1965)], amelyben a szokásos ábrázolással összhangban az N-terminális aminosav a bal oldalon, a C-terminális aminosav a jobb oldalon található. Ha az aminosavnak izomer formái vannak, akkor ha kifejezetten másként nem jelzik, az L-forma szerepel. A találmány tárgya eljárás a következő képletű : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr- Arg-Lys-Rl3-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys- Leu-Leu-Gln-Ile-Met-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu- Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-R4,-Val-Arg- Leu-Y (I) szintetikus GRF peptidek előállítására, ahol Ru jelentése Val vagy Ile; R28 jelentése Ser vagy Asn; R41 jelentése Arg vagy Lys; Y jelentése hidroxicsoport vagy amínocsoport. A kiindulási peptideket bármely megfelelő módszerrel szintetizálhatjuk, pl. kizárólagos szilárdfázisú technikával, részleges szilárd-fázisú technikával, fragment kondenzációval, vagy klasszikus oldatban végrehajtott kapcsolással. A kizárólagos szilárd-fázisú szintézis technikáját pl. a következő könyvben ismertették („Solid-Phase Peptide Synthesis”, Stewart and Young, Freeman and Co., San Francisco, 1969), és az 1978. augusztus 8-án nyilvánosságra hozott 4 105 603 számú amerikai szabadalmi leírásban közöltek rá példákat. A szintézis fragment-kondenzációs módszerét az 1976. augusztus 3-án nyilvánosságra hozott 3 972 859 sorszámú amerikai szabadalmi leírásban közük példákkal. Más, hozzáférhető szintézis-módszereket az 1974. október 6-án nyilvánosságra hozott 3 842 067 számú és az 1975. január 28-án nyilvánosságra hozott 3 862 925 számú amerikai szabadalmi leírásban közölnek. A kapcsolás-típusú szintézisekkel közös a különböző aminosav-egységek érzékeny oldallánccsoportjainak megfelelő csoportokkal való védelme, mely megakadályozza, hogy kémiai reakció játszódjék le az adott helyen mindaddig, míg a védőcsoportot el nem távolítjuk. Szokás továbbá egy aminosav vagy fragment alfa-amino-csoportjának védelme, mialatt a molekula a karboxilcsoportjával reagál, majd az alfa-amino-védőcsoport szelektív eltávolítása, hogy ezen a helyen lejátszódhasson a következő kémiai reakció. Ennek megfelelően a szintézis első lépése egy olyan közbenső termék előállítása, melyben az aminosav-csoportok a megfelelő sorrendben találhatók a peptidláncban, és az oldallánc védőcsoportok a megfelelő csoportokhoz kapcsolódnak. A találmány szerint (II) általános képletű közbenső termékeket alkalmazunk : X1 -T y r(X2)-Alá-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
