190836. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens low density lipoproteinek meghatározására
1 190 836 2 A találmány tárgya eljárás és reagens low density lipoproteinek meghatározására. Az LDL-frakció (Low Density Lipoprotein) - amelyet ß-lipoproteinfrakcionak is neveznek - meghatározása Iipoid-anyagcserezavar differenciált diagnózisa szempontjából kiemelkedő jelentőségre tett szert. Hiperkoleszterinémia és hipertrigiiceridémia elősegítik az érelmeszesedés és a szívinfarktus létrejöttét. A koleszterin és trigliceridek szérumban való meghatározása ezért a legfontosabb elvégzendő vizsgálatok közé tartozik a klinikai-kémiai rutinlaboratóriumban. A zsíranyagcserére vonatkozó számos vizsgálat arra a következtetésre jutott, hogy az egyedi koszorúér-elmeszesedés veszélye jobban felismerhető, ha nemcsak a triglicerid- és koleszterin-tükörben beálló változásokat határozzuk meg, hanem a lipoprotein mintában alapul vehető patológiás elváltozásokat is kiderítjük [Münch, med. Wschr. 121, 1639 (1979)]. Az ismert plazmalipoproteinek különböző részarányban tartalmaznak proteint (apolipoproteinek), foszfolipideket, koleszterint és triglicerideket. Az analitikai ultracentrifugában való viselkedésük (eltérő sűrűség) és a gélelektroforézisben tapasztalható eltérő vándorlási sebességük alapján négy különböző osztályba sorolhatók: chylomikronok pre-ß-lipoproteinek = VLDL (very low density lipoprotein) ß-lipoproteinek = LDL (low density lipoprotein) a-lipoproteinek = HDL (high density lipoprotein). A lipoproteinek funkciójának vizsgálata azt eredményezte, hogy az LDL a lipoproteineken belül a döntő érelmeszesedést előidéző komponenst jelenti, amelynek a vérben való felszaporodásakor fokozott veszély áll fenn koszorúér szívbetegségre. Ennek az állapotnak a korai felismerése és elhárítása nagyjelentőségű. Ezért igény van egy gyakorlatilag jól alkalmazható eljárásra a LDL-koncentráció szérumban és plazmában való kvantitatív meghatározására. Eddig az LDL-koleszterinérték meghatározására lényegében három módszert használtak, amelyeknek azonban hátrányaik vannak : 1. Ultracentrifugálás. Ez az eljárás rutinlaboratórium részére nem megfelelő, mivel ehhez speciális készülék-ellátottság szükséges, és a kivitelezés rendkívül gondos munkamódszert és az ultracentrifugán nagyon nagy időráfordítást (többszöri centrifugálás) igényel. Ezért ezt az analíziseljárást eddig csak a kutatóorvosi laboratórium részére tartják fenn. 2. Elektroforetikus elválasztás a lipoproteinsávok ezt követően polianionos lecsapással való láthatóvá tételével, és a zavarosodási egységek átszámítása koleszterin-értékekre. Ez az eljárás szintén időigényes és saját elektroforézis-készüléket igényel, valamint denzitométert a kiértékelésre. [Lab. Med. 1, 145 (1977)]. 3. A LDL-koleszterin-érték meghatározása a Friedewald-képlettel [Clin. Chem. 18, 499 (1972)]. Az LDL-koleszterin-értékeknek a Friedewaldképlet szerinti kiszámításához 3 paraméter meghatározása szükséges: a minta koleszterin-, HDL- koleszterin- és triglicerid-értéke. A módszer ezért nem kielégítően gyakorlatias. Azonkívül ez a közelítő képlet csak chylomikronmentes mintákra és 400 mg/dl alatti triglicerid-értékű mintákra érvényes. 4. Kicsapási reakciók. Olyan eljárást, amelyben az LDL-t valamilyen lektin segítségével csapnak le, a 28 57 710 sz. német szövetségi kőztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratban imák le. Az LDL-koleszterin-érték azonban ennél a módszernél is csak a csapadék újrafeloldása után, illetve a koleszterin-értékek lecsapás előtti és utáni különbségképzésével állapítható meg. Ez jelentős hátrányt jelent. A lipoproteinek lecsapására szolgáló olyan módszer, amelynél az LDL a csapadék felülúszójában marad, a 26 00 664 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásban van leírva. A módszer azonban rutinmeghatározásként való alkalmazásra nem kielégítően gyakorlatias, mivel a lipoproteinek kicsapására 2 munkamenet szükséges (két különböző ágens - polietilén-imin és egy kationcserélő - hozzáadása, összekapcsolva egy közbülső inkubációs fázissal). Ezért igény van az LDL-lipoproteinek meghatározásához egy gyakorlatilag jól alkalmazható és nagy meghatározási pontosságú egyszerű eljárásra és reagensre. Ezt a feladatot a találmány szerint a low density lipoproteinek (LDL) testfolyadékokban való meghatározására szolgáló olyan eljárással oldottuk meg, amelyre az jellemző, hogy a vizsgálandó mintához high density lipoprotein (H DL)-anti testeket adunk, a keletkező csapadékot elválasztjuk, és a felülúszóban az LDL-t vagy komponenseinek egyikét meghatározzuk. A találmány azon a meglepő megállapításon alapul, hogy HDL-antitestekkel valamennyi, az LDL- meghatározást zavaró lipoprotein-frakció, a HDL mellett különösen a VLDL és a chylomikronok is, lecsapható, az LDL-t magát viszont a csapadék nem köti meg. Ez különösen azért meglepő, mert mind a HDL, mind az LDL, VLDL és a chylomikronok egy olyan proteinrészlettel rendelkeznek, amely azonos apoliproteineket tartalmaz, ha nagyon eltérő koncentrációban is. Ezért nem volt előrelátható, hogy a HDL-antitestek nemcsak a HDL-t, hanem a VLDL-t és a chylomikronokat is kvantitatíve lecsapják anélkül, hogy emellett az LDL-t befolyásolnák. A VLDL és chylomikronok lecsapása meggyorsítható, amennyiben ezekhez az anyagokhoz pótlólag ismert lecsapószereket alkalmazunk. [Okabe, X. Int. Congr. of Clin. Chem., Mexico, (1978)]. A reagens felülúszójában maradó LDL-frakció utána az erre szokásos módszerekkel meghatározható [pl. Siedel, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 19 (1981) 836], A benne levő kötött koleszterin meghatározása előnyösen az erre ismert módszerek alkalmazásával történik. így a meghatározás például alkoholos kálium-hidroxid oldattal való elszáppanosítással, és Liebermann-Burchard-féle kémiai 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 1
