190836. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens low density lipoproteinek meghatározására
1 190 836 2 meghatározással végezhető. Előnyösen végezhető azonban egy enzimatikus meghatározás is koleszterin-oxidáz és egy koleszterin-észtereket hasító enzim vagy enzimrendszer, különösen koleszterinészteráz alkalmazásával. Az utóbbi módszer alkalmazásakor az elhasznált oxigén, a képződött kolesztenon, vagy legelőnyösebben a keletkezett hidrogénperoxid mérhet a szakember számára ezen a területen ismert módszerekkel. [Trinder, Ann. Clin. Biochem. 6 (1969) 24; Töschlau, Z. Klin. Chem. Kiin. Biochem. 12 (1974) 403]. Megjegyzendő azonban, hogy a találmány szerinti eljárás keretében a VLDL- és chylomikron-frakciók eltávolításával zavarosodás fellépését gátoljuk meg, amely kolesztenon vagy hidrogén-peroxid színreakciók keretében való optikai mérését zavarhatják. Az eljárás ezért különleges mértékben összefügg egy kalorimetrjás koleszterin meghatározási módszerrel. Az is lehetséges azonban, hogy az LDL-frakcióban levő koleszterin, illetve más LDL-komponensek, így apoliprotein B, foszfolipidek és trigliceridok helyett magát az LDL-frakciót határozzuk meg, amire szintén önmagukban ismert módszerek használhatók. Példaként a nefelometriás meghatározás vagy a 30 07 764 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratban leírt turbidimetriás meghatározás említhető. A foszfolipidek foszfolipázzal, kolinoxidázzal, peroxidázzal és ezt követő - fentiekben említett - H202-meghatározással határozhatók meg, a trigliceridek észterázzal, glicerin-foszfatoxidázzal, glicerikonázzal és peroxidázzal, valamint ugyancsak ezt követő H202 meghatározással mérhetők. A HDL-antitesteket a találmány keretében vagy valamilyen HDL-antiszérum formájában, mint zsírmentesitett HDL-antiszérumot vagy tisztított HDL-antitestfrakció formájában használjuk. Lehetséges az is, hogy a HDL A, C vagy/és E apolipoproteinjei vagy ezek fragmensei elleni antitesteket alkalmazzunk. Végül monoklonális HDL-antitestek is alkalmazhatók. A találmány szerint alkalmazott antitestek előállítása tiszta HDL vagy az említett apoliproteinek immunogénként való alkalmazásával történik. Az antitest-kinyerésre a szokásosan használt állatfajok vehetők igénybe. Előnyös a birka és a nyúl. Az antitest-kinyerésre azonban a már említett állatokon, illetve összehasonlítható élőlényeken kívül sejttenyészetek is használhatók. A HDL-antitestek hozzáadásakor keletkező immun aggregátumok elválasztása szintén szokásos módszerekkel történhet. Amennyiben oldható HDL-antitesteket alkalmazunk, úgy az elválasztás célszerűen centrifugálással történik. Immunogénként előnyösen tisztított teljes HDL-frakciót használunk. A tisztítás célszerűen önmagában ismert módon az ultracentrifugában való elkülönítéssel történik. Kiegészítésként adott esetben további tisztítás végezhető például immobilizált konkanavalin A-n az affinitás-kromatográfia módszerei szerint vagy elektroforézissel. [FEBS Lett. 91 (1974) 174-198 és J. Lipid. Res. 18 (1977) 314-324]. A találmány tárgyát képezi továbbá LDL-frakció testfolyadékokból való meghatározására szolgáló reagens is, amelyre az jellemző, hogy HDL-antitesteket tartalmaz. Egy előnyös kiviteli formában a találmány szerinti reagens a már említett HDL-antitestek, illetve az előbb a találmány magyarázatánál közelebbről leírt fragmensek vagy antitestek, illetve HDL-komponensek fragmensei mellett még egy koleszterin meghatározására szolgáló reagenst is tartalmaz. Egy előbb említett fajtájú előnyös reagens koleszterinoxidázt, koleszterinésztert hasító enzimet vagy enzimrendszert, hidrogén-peroxid meghatározására szolgáló rendszert és egy felületaktív anyagot tartalmaz. Az előbb említett reagens egy különösen előnyös kiviteli alakja szerint ez lényegében HDL-antitestekből, koleszterinoxidázból, koleszterinészterázból, peroxidázból, 3,4-diklór-fenolból, fenolból, 4-amino-fenazonból, [2,3-dimetil-4-(dimetilamino)-l-fenil-3-pirazoün-5-on] egy nem ionos detergensböl, magnézium-aszpartátból és 7-8,5 pH- jú pufferből áll. A találmány szerinti reagens az antitestet célszerűen 10_7-10-3 mól/liter (illetve kg szilárd anyag) koncentrációtartományban tartalmazza a meghatározó oldatra vonatkoztatva. Az antitest szilárd formában, előnyösen liofilizálva, vagy oldat formájában fordul elő. Oldószerként víz, fiziológiás konyhasóoldat, szérum, pufferok, igy például 0,01-0,5 mólos (7-8,5 pH-jú) trisz-puffer, vagy 0,005-0,1 mólos (6,5-8,5 pH-jú) foszfátpuffer, adott esetben fiziológiás konyhasóoldatok nagyságrendjébe eső konyhasóadalékkal alkalmazhatók. Amennyiben az antitestet immobilizált formában alkalmazzuk, úgy alkalmas hordozóanyagokra példaként poliszacharidok, így cellulóz, dex trán, keményítő és ezek származékai, szilikátok, poliamidok, kollagén, latex, alumínium-oxid, marhaszérumalbumin és hasonló hordozóanyagok említhetők. Az antitest lehet a vizsgálati edények, például műanyag reagens-üvegek felületére is felkötve. A reagens ezenkívül VLDL és chylomikronok lecsapódására alkalmas ismert szereket is tartalmazhat [pl. J. Lipid. Res. 11 (1970) 583 és Clin. Chem. 23 (1977) 882], A találmány szerinti eljárás jelentős előnye abban van, hogy egyetlen reagens hozzáadása után a lipoproteinek - LDL kivételével - a mintából eltávolíthatók, és a diagnosztikailag lényeges LDL- tartalom vagy az LDL-frakció koleszterintartalma végül további kezelés nélkül közvetlen méréshez hozzáférhető. Előnyös továbbá, hogy a mintában zavarosodásokat okozó trigliceridben gazdag lipoproteineket eltávolítjuk úgy, hogy a végső LDL- vagy koleszterin-meghatározáshoz tiszta minta áll rendelkezésre. A következő példák egy előnyös kiviteli alak segítségével szemléltetik a találmányt. 1. példa A) Tisztított HDL előállítása. VLDL és LDL ultracentrifugában való leválasztása után egy szűk HDL-frakciót (d = 1,080-1,210) különítünk el az ultracentrifugában, ahogy V. P. Skipski leírja. [Lipid composi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
