190796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-dihidrotiazolil-3-kinolin-karboxamid származékok előállítására
1 190 796 2 4 °C-on centrifugáljuk. A friss maradékot 50 ml Krebs trisz HCl pufferbe helyezzük, melynek pH- értéke 7,4. 2 ml szuszpenziót ezután 30 percig 0 °C-on inkubáljuk 3H diazepam jelenlétében 10~9 mól, önmagában, a teszttermék növekvő koncentrációja mellett, vagy pedig a nem-specifikus rögzítés meghatározása céljából nem radioaktív diazepammal 106 mól koncentráció mellett. Az inkubált szuszpenziókat Whatman GF/C szűrőn leszűrjük és a szűrletet kétszer 5 ml Krebs HCl pufferrel mossuk 0 °C-on, a puffer pH értéke 7,4. A szűrőn lévő maradék radioaktivitását folyadékszcintillációval mérjük. Ez az a koncentráció, amely a 3H diazepam specifikus kötését 50%-osan gátolja. Ennek meghatározása grafikusan történik. Eredmények : Példaszám . IC50 nM 1 0,5 2 0,3 3 1,5 4 2,2 5 0,9 6 1,0 7 1,3 8 1,2 9 2,6 10. 15 20 25 30 2. 4-lemez teszt (szorongásfeloldó hatás) Módszer: A készüléket (Apelab) és a módszert Boissier és társai írták le (European J. Pharmacol. 1968. 4, 145). A lemezeket egy stimulátorhoz kapcsoljuk (U. Sachs, Roucaire) amely 120 voltos elektromos 35 sokkokat idéz elő fél másodperc időtartamra. A tesztet 10 egéren hajtjuk végre fél órával azután, hogy beadagoltuk per os a vizsgálandó anyagot. Minden állatot külön helyezünk a készülékre. 15 perc szabad vizsgálat után az állatot, ahogy az egyik lemezről a másikra halad elektromos sokkhatásnak tesszük ki és két sokk között legalább 3 mp szünetet tartunk. Megszámoljuk a sokkok számát egy perc alatt. A kapott eredményt Dunnett teszttel összevetjük a kontroll állatoknál kapott eredményekkel. Az alábbiakban közöljük az orális dózist, melynél a sokkok számát maximálisan növeltük az alábbiakban mutatjuk meg: Példaszám Dózis mg/kg 1 10 2 20 4 20 6 50 8 20 9 10 Az l, 2, 4, 6, 8 és 9. példák termékei tehát jó szorongásoldó hatást mutatnak. 40 45 50 3. Zaj által keltett stress-re gyakorolt hatás plasma 60 corticosteron mennyiségéből kimutatva (szorongásoldó hatás) Módszer: A tesztet 5 patkányból álló csoportokon hajtjuk végre, a vizsgált vegyületet per os adagoljuk reggel 65 8 és 9 óra között úgy, hogy az állatokat már 24 órája ötös csoportokban tartjuk. Egy órával később stresshalást alkalmazunk, amely abból áll, hogy az állatokat egy ketrecből egy olyan szobába visszük, melyben egy rádió hangosra van állítva, majd egy fél óra múlva intraperitoneális injekciót adunk az állatoknak. 10 perc múlva a patkányokat halotánnal érzéstelenítjük és az állatok levágása után 3 ml vért távolítunk el. A corticosteron szérum mennyiségét rádióim munológiai módszerrel határozzuk meg. Szem előtt tartva a hímnemű patkány méretét, közvetlenül meghatározzuk a corticosteron koncentrációt a szérumban, anélkül, hogy a hormont előzőleg extraháltuk volna, 0,1 ml mintát Víoo arányban hígítunk. A mintához 12*65 mm-es hematolízis kémcsövekben 0,1 ml 500 spm 3H corticosteron vizes oldatot és 0,5 ml 0,02 mól pH = 6,9 értékű foszfátpuffert adunk, melyhez előzőleg hozzáadtunk 0,02% zselatint és 0,02% nátriumnitridet, amely 1/300 000 hígításban anticorticosteron antiszérumot tartalmaz szuszpenzióban, továbbá nyúl antigammaglobulin bárány antiszérumot 1/rO hígításban és aktív szén dextránnal kezelt normál nyúlszérumot '/soo hígításban. A térfogatot l ml-re állítjuk be és az elegyet éjjel 4 °C-on inkubáljuk. 3000 percenkénti fordulatszám mellett centrifugáljuk és a felülúszót eltávolítjuk és a csapadékban lévő radioaktivitást egy számlálón mérjük, miután 2 ml 5% Soluene 350-et tartalmazó szcintillációs folyadékot adtunk hozzá. A corticosteron koncentrációkat kalibrációs görbével határozzuk meg (0-4000 pg), melyet a minta kezelésének körülményei között állítottunk fel. A corticosteron egyes szérummennyiségeit pg/ 100 ml-ben fejeztük ki és ez az érték három meghatározás átlaga. Az eredményeket Student-féle teszttel hasonlítottuk össze a kontrollállatoknál kapott eredményekkel, mely állatokat azonos teszthatásnak tettük ki. Az eredményeket ED50-ben fejeztük ki (hatásos dózis 50), azaz az a dózis, melyet per os adagoltunk és amely a kezelt állatok corticosteron mennyiségét 50%-kal csökkenti. Eredmények : Példaszám ED50 mg/kg 1 10 2 15 4 50 6 50 9 10 A stresshatás a kezelt állatokban kevésbé jelentős, ezért tehát ezek az állatok kisebbfokú szorongást mutatnak, mint a kontroll állatok. 4. Akut toxicitás vizsgálata A különböző vegyületek letális dózisát, azaz LD0 értékét orális adagolás után értékeltük ki egéren. A maximális dózis, amely nem okoz mortalitást 8 napig az LD0. A kapott eredmények a következők : Példa száma LD0 mg/kg 1 > 400 2 > 400 4 > 1000 5 > 1000 6 > 400 8 > 400 9 > 1000 7
