190784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroid-vegyületek mikrobiológiai átalakításának intenzifikálására

1

190 784

2

lemossuk és az így kapott, 15-20 mg/cm3 sejt-szárazanyagot tartalmazó sejtszuszpenzió 1 ml-jével beoltunk 100 ml alábbi összetételű tápközeget:

0,1 súly% élesztőkivonat (szilárd por)

0,1 súly% ammónium-klorid 5

0,05 súly% kálium-dihidrogén-foszfát

0,2 súly% kazein-hidrolizátum (szilárd por)

0,5 súly% glicerin.

A tenyészetet 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 32 °C hőmérsékleten 230 percenkénti löketszámú 10 rázóasztalon 2 napig inkubáljuk, majd az így kapott oltótenyészet 10-10 cm3-ével indítjuk meg a biokonverziót, 4 párhuzamos kísérletben, 100-100 cm3 térfogatú tápközegben. A tápközeg összetétele: 15

2 súly% kukoricalekvár (50% szárazanyag-tartalommal, szárazanyagra számítva)

0,1 súly% élesztőkivonat (szilárd készítmény)

0,2 súly% szójaliszt

0,15 súly% kálium-dihidrogén-foszfát.

Az egyes biokonverziós kísérletekben a kiindulási szteroidként alkalmazott ß-szitoszterint és a ßciklodextrint az alábbi koncentrációban adtuk a

121 °C hőmérsékleten 30 percig sterilezett, majd 32 °C-on a fenti oldótenyészettel beoltott tápközeghez:

Kísérlet

A

B

C

D

ß-szitoszterin ß-ciklodextrin

0,2% 0,1%

0,4% 0,2%

0,2%

0,4%

20

25

30

A biokonverzióstenyészetet 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikban, 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon 32 °C hőmérsékleten 168 óra hosszat inkubáljuk. Az átalakítás végén a fermentlében vál- 35 tozatlanul maradt kiindulási szteroid mellett főként

androszta-1,4-dién-3,17-dion

található az

alábbi

mennyiségekben : Kísérlet

A

B C

D

androszta-1,4-dién-3,17-dion mg/cm3

0,70

1,20 0,50

40

0,60

Amint a fenti eredmények mutatják, ciklodextrin jelenlétében nemcsak a termék hozama növekszik lényeges mértékben, hanem a kiindulási szteroid koncentrációja is növelhető, a termékhozam lénye- 45 ges mértékű csökkenése nélkül.

7. példa

Progeszteron átalakítása 50

21-hidroxi-progeszteronná

121 °C-on 30 percig sterilezett sörcefrét (szárazanyagtartalom 5 súly%, pH = 5,9) két 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikban, 100-100 ml mennyiségben 55 beoltunk egy ferde agar-táptalajról lemosott Ophiobolus herpotrichus (ATCC 12279) sejtszuszpenzióval. A tenyészetet 28 °C hőmérsékleten, 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon 3 napig rázatjuk, majd 25-25 mg progeszteron 0,6 cm3 acetonnaí 60 készített és sterilre szűrt oldatát adjuk mindkét tenyészethez. Az inkubálást további 3 napig folytatjuk a fenti körülmények között. A progeszteron hozzáadása után 1 nappal az egyik lombik tartalmához 75 mg béta-ciklodextrin 2 ml vízzel készített 65

és 121 °C hőmérsékleten 20 percig sterilizált oldatát adjuk, míg a másik lombik tartalmához csupán 2 cm3 steril vizet adunk.

A biokonverzió befejezésekor a ciklodextránnal kezelt fermentlében 0,170 mg/cm3 21-hidroxiprogeszteront és 0,015 mg/cm3 átalakulatlan progeszteront, míg a ciklodextrin nélküli fermentlében 0,150 mg/cm3 21-hidroxi-progeszteront és 0,036 mg/cm3 átalakulatlan progeszteront találunk.

8. példa

16a-Metil-Reichstein-S átalakítása 16a-metil-hidrokortizonná.

Curvularia lunata (ATCC 12017) mikroorganizmus ferde agar-tenyészetéről lemosott spórák szuszpenziójával a 4. példában leírt módon, két párhuzamos kísérletben beoltunk 100-100 cm3 tápközeget (a 4. példában megadottal azonos összetételben). A még növekedésben levő, 16 órás tenyészetekhez 60-60 mg 16a-metil-Reichstein-S 3 ml metanollal készített és sterilre szűrt oldatát adjuk. Ezután az egyik lombikba 180 mg ciklodextrin (béta- és gamma-ciklodextrin elegye) 3 ml vízzel készített és 121 °C-on 20 percig sterilezett oldatát adagoljuk, míg a másik lombikhoz csupán 3 ml steril vizet adunk. Az inkubálást a 4. példában leírt módon 48 óra hosszat folytatjuk, majd a biokonverziós reakciót leállítjuk.

A biokonverzió termékeként keletkezett 16a-metil-hidrokortizon koncentrációja a ciklodextrínnel kezelt tenyészetben 0,42 mg/cm3, míg a ciklodextrin nélküli tenyészetben csupán 0,34 mg/cm3.

9. példa

3$,17a,2I~trihidroxi-5-pregnén-20-on~21-acetát átalakítása Reichstein-S vegyületté

Flavobacterium dehydrogenans (ATCC 13930) mikroorganizmusnak a 3. példában leirt módon elkészített és az átalakításhoz szükséges enzimek termelésére indukált tenyészetéhez a szükséges 3ßhidroxi-szteroid-oxidoreduktáz és acil-szteroidészteráz enzimaktivitás ellenőrzése után (amihez körülbelül 12 órai tenyésztés szükséges) négy 500 cm3-es, egyenként 100 ml tenyészetet tartalmazó rázólombikban az alábbi anyagokat adjuk :

A: 1 g átalakítandó szteroid 0,05 g Tween 80-at tartalmazó 8 g vízzel készített oldata ;

B: 2 g átalakítandó szteroid 0,05 g Tween 80-at tartalmazó 8 g vízzel készített oldata;

C: 1 g átalakítandó szteroid 0,05 g Tween 80-at tartalmazó 5 g vízzel és 1 g ciklodextrin (alfa- és béta-ciklodextrin elegye) 3 g vízzel készített oldata ;

D: 2 g átalakítandó szteroid 0,05 g Tween 80-at tartalmazó 5 g vízzel és 1 g ciklodextrin (alfa- és béta-ciklodextrin elegye) 3 g vízzel készített oldata.

A fenti, steril állapotban hozzáadott oldatok beadagolása után az inkubálást 30 °C hőmérsékleten, 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon további 12 óra hosszat folytatjuk. A biokonverzió befejezése után az egyes lombikokban a termékként kapott Reichstein-S vegyület koncentrációja: A lombik:

6