190784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroid-vegyületek mikrobiológiai átalakításának intenzifikálására
1 190 784 2 szat folytatjuk, majd a tenyészet 10 cm3-ével a fentivel azonos méretű lombikban beoltunk 100 cm3 tápközeget, amely malátakivonatot nem tartalmaz, egyébként a fentivel egyező összetételű. A mikroorganizmust 26 °C hőmérsékleten történő rázatás közben felszaporítjuk és a még növekedésben levő, 16 órás tenyészethez hozzáadjuk 0,12 g Reichstein-S-17-acetát (pregn-4-én-17a,21 -dihidroxi-3,20-dion-17-acetát) 3 cm3 metanollal készített oldatát. A további inkubálás során a tenyészet a szteroidot a 11 ß-helyzetben hidroxilezi hidrokortizon-17- acetáttá. A biokonverzió előrehaladását rétegkromatográfiával követjük; a biokonverzió 20. órájában, amikor az átalakulatlan kiindulási szteroid mennyisége körülbelül 10 súly%, 0,96 g béta-ciklodextrint adunk a biokonverziós elegyhez. A még tovább folyó és vége felé lelassuló hidroxilezés mellett felgyorsulva megy végbe a szteroid acetilcsoportjának lehasítása. 3 óra után a biokonverziót befejezzük ; ekkor a fermentációs elegyben a következő anyagokat találjuk : 0,730 mg/cm3 hidrokortizon (1 ip,17a,21-trihidroxi-4-pregnén-3,20-dion), 0,185 mg/cm3 hidrokortizon-17-acetát, 0,040 mg/ cm3 Reichstein-S, 0,005 mg/cm3 Reichstein-S-17- acetát. A kontrollként azonos körülmények között, ugyanannyi ideig, de béta-ciklodextrin hozzáadása nélkül lefolytatott biokonverzió után a fermentációs elegyben a fenti anyagok koncentrációja a következő: 0,210 mg/cm3 hidrokortizon, 0,766 mg/ cm3 hidrokortizon-17-acetát, 0,020 mg/cm3 Reichstein-S, 0,027 mg/cm3 Reichstein-S-17-acetát. A biokonverzió már előrehaladott szakaszában hozzáadott béta-ciklodextrin tehá't elsősorban az észtercsoport lehasítási reakcióját gyorsítja ; ugyanakkor azonban elősegíti a hidroxilezési reakció befejeződését is. 5. példa Hidrokortizon átalakítása prednizolonná Laboratóriumi fermentorban 5 liter steril tápközeget, amelynek összetétele: 0,3 súly% glükóz 0,3 súly% pep ton 0,1 súly% élesztőkivonat (porlasztással szárított, poralakú készítmény) pH = 6,8 beoltunk Arthrobacter simplex (ATCC 6946) szilárd táptalajon nőtt tenyészetéről lemosott 30 cm3 sejtszuszpenzióval. A tenyésztést 35 °C hőmérsékleten, 240 fordulat/perc kevertetéssel, 0,5 liter/liter/ perc levegőztetés mellett 20 óra hosszat folytatjuk. Az így kapott tenyészet 1 literjével beoltunk egy laboratóriumi fermentorban sterilezett 9 liter tápközeget, amelynek összetétele: 0,5 súly% glükóz 0,5 súly% pepton 0,4 súly% élesztőkivonat (száraz, por alakú) pH = 6,8. A tenyésztést 0,3 liter/liter/perc levegőztetés és 600 fordulat/perc keverés mellett, 35 °C hőmérsékleten 18 óra hosszat folytatjuk; ekkor az enzim kialakulásának indukálására 0,5 g hidrokortizon 50 cm3 metanollal készített oldatát adjuk hozzá. További 4 órai inkubálás után az így aktivált tenyészetet a biokonverzió előre elkészített közegét tartalmazó saválló készülékbe nyomatjuk. A közeg elkészítése: a készülékbe 90 liter csapvizet töltünk, 1200 g béta-ciklodextrint adunk hozzá, majd a készüléket 100 °C hőmérsékletre fűtjük és a közeget ezen a hőmérsékleten 20 percig sterilezzük, majd 35 °C-ra hűtjük le. 4 liter metanolban 400 g kalcium-kloridot, majd 1,0 g 2-metil-l,4-naftokinont és 400 g hidrokortizont oldunk, az oldatot sterilre szűrjük és bevisszük a saválló készülékbe. Ezután vezetjük hozzá a fenti módon elkészített tenyészetet, amikoris a biokonverziós folyamat megindul. Ekkor az átalakítandó szteroid már gyakorlatilag oldott állapotban van, ami azért fontos, mert kiküszöböli azt a veszélyt, hogy a termék kiválásának megújulásakor elegykristály képződjék a kiindulási szteroidból és a termékből. A biokonverziót 35 °C hőmérsékleten, 180 fordulat/perc keverés és 0,6 liter/liter/perc levegőztetés mellett folytatjuk és vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal ellenőrizzük. Amikor az átalakulatlan hidrokortizon mennyisége már 2,0 súly%-ra csökken, a biokonverziós reakciót leállítjuk, a fermentlevet ellenáramú extrakcióval - szilárd anyag jelenlétét megengedő berendezés, például forgótárcsás extraktor alkalmazásával - etil-acetáttal kétszer ismételve extraháljuk. Az egyesített szerves oldószeres kivonatot vákuumban, 40 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten 8 g/liter szárazanyag-koncentrációig (körülbelül 50 liter térfogatig) bepároljuk, 40 g aktívszén és 100 g Celite keverékével derítjük, leszűrjük és a bepárlást a kristályosodásig - körülbelül 2 liter térfogatig ® folytatjuk. A kapott szuszpenziót 5-10 °C hőmérsékletre hűtjük, néhány órai állás után leszűrjük ; az anyalúgot ötszörös mennyiségű diizopropil-éterrel elegyítjük, az így leválasztott további terméket szűréssel elkülönítjük. A termék összemennyisége 375 g, minőségi jellemzői : tartalom 98 súly % szárítási veszteség 1 súly% szulfáthamu 0,1 súly% maradék hidrokortizon 1,2 súly% egyéb szteroid 0,35 súly % (a]p = +98° (dioxán, c = 1 súly%) A béta-ciklodextrin visszanyerése céljából a fentiek során extrahált fermentlevet 1 liter ciklohexánnal 1 óra hosszat keverjük 18-20 °C hőmérsékleten. A keletkező csapadékot szűréssel elkülönítjük, 1 liter vízben szuszpendáljuk és a ciklohexánt vízgőzdesztillációval kihajtjuk. A visszamaradó vizes béta-ciklodextrin-szuszpenziót éjjelen át 5-10 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a kivált kristályokat szűréssel elkülönítjük és vákuumban megszárítjuk. így körülbelül 700 g újból felhasználható bétaciklodextrint nyerünk vissza. 6. példa Szitoszterin átalakítása androszta-1,4-dién-3,l 7-dionná Mycobacterium sp. (NRRL B-3683) ferde agar táptalajon nőtt tenyészetét fiziológiás sóoldattal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
