190784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroid-vegyületek mikrobiológiai átalakításának intenzifikálására
1 190 784 2 oldatát adjuk a tenyészethez a szükséges enzim indukálása céljából. Az indukálást 3 óra hosszat, a tenyésztéssel azonos körülmények között végezzük. Az így kapott, A'-dehidrogenáz enzimet tartalmazó tenyészet 50 cm3-ét egy 950 cm3 steril vizet tartalmazó 3 literes Erlenmeyer-lombikba adagoljuk és az így 20-szorosára hígított aktív tenyészettel folytatjuk le a biokonverziót. A tenyészethez 20 g alfa-ciklodextrint adunk, majd ennek oldódása után adjuk hozzá átalakítandó szubsztrátként a 10% kalcium-kloridot tartalmazó 20 cm3 metanolban oldott 2 g hidrokortizont. Az átalakítási reakciót a fentebb említett rázógépen 5 óra hosszat folytatjuk 32 °C hőmérsékleten. Az alfa-ciklodextrin jelenléte megakadályozza a vizes közegbe beadagolt hidrokortizonnak az oldatból kiválását; az oldott hidrokortizon átalakulása az enzim aktivitása által megengedett legnagyobb sebességgel megy végbe, tehát gyorsabban, mint ha a hidrokortizon a szokásos eljárás szerint, szuszpenzió alakjában lenne jelen a biokonverziós rendszerben, amelyben az átalakítás - ciklodextrin nélkül - csak 8 óra alatt menne végbe. Az átalakítási folyamat végén a fermentlé szteroidtartalma : 1920 pg/cm3 prednizolon, 40 pg/cm3 20ß-hidroxi-prednizolon és 8 pg/cm3 (átalakulatlan) hidrokortizon. 2. példa 17a-Metil-tesztoszteronAv~dehidrogénezése Az 1. példa szerint előállított és indukált tenyészetet ötszörös térfogatra hígítjuk és metil-tesztoszteron A'-dehidrogénezésére használjuk oly módon, hogy a biokonverzió megindításához 1,0 g metiltesztoszteront adagolunk 10 cm3 metanollal készített oldat alakjában a ciklodextrint tartalmazó tenyészethez. Az átalakulást vékonyréteg-kromatográfiával ellenőrizzük. A beadagolt metil-tesztoszteron először kiválik a közegből, majd fokozatos oldódás közben dehidrogéneződik. Körülbelül 400 pg/cm3 A’-metil-tesztoszteron szint elérésekor 6,0 g béta-ciklodextrint adunk a rendszerhez. Ez az adalék a keletkező dehidrogénezett terméket komplexkötésbe viszi ; erre azért van szükség, mert az enzimes reakció a képződött termék mennyiségének túlsúlyra jutásakor az ismert termékgátlási mechanizmus folytán az átalakulási reakció lelassulna, majd teljesen leállna. A béta-ciklodextrin komplexképző hajlama a termékkel szemben körülbelül ötszörösen nagyobb, mint a kiindulási metil-tesztoszteronnal szemben. A ciklodextrin beadagolása az átalakulás 2. órájában történik; a biokonverziós reakciót a rétegkromatográfiás vizsgálat alapján a 6. órában fejezzük be. Az átalakítás végén a fermentlé szteroidtartalma: 970 pg/cm3 A'-metil-tesztoszteron, 6 pg/cm3 (átalakulatlan) metil-tesztoszteron. Ha a biokonverziós reakciót a fent leírt módon, de ciklodextrin hozzáadása nélkül folytatjuk le, akkor a reakció már 100-120 pg/cm3 átalakulatlan szubsztrát-koncentrációnál leáll. 3. példa 5-Pregnén-3$,17a,21 -trihidroxi-20-on-21-acetát átalakítása ReichsteinS vegyületté Flavobacterium lucecoloratum (N.C.I. B. 9324) ferde agar-tenyészetével egy 750 cm3-es Erlenmeyer-lombikban beoltunk 200 cm3 steril tápközeget, amelynek összetétele: 1,0 súly% élesztőkivonat (porlasztással szárított, poralakú készítmény), 0,1 súly% kálium-dihidrogén-foszfát és 0,4 súly% dikálium-hidrogén-foszfát. A tenyésztést percenként 230/perc löketszámú síkrázógépen, 30 °C hőmérsékleten 20 óra hosszat folytatjuk, majd az így kapott tenyészettel egy laboratóriumi fermentorba beoltunk 5 liter fentivel azonos összetételű steril tápközeget. A beoltott tápközeghez hozzáadjuk 250 mg 5- pregnén-3p, 17a,21 -trihidroxi-di-on-21 -acetát 1,5 cm3 dimetil-formamiddal készített és sterilre szűrt oldatát. Az átalakítandó szteroidnak a közegben való jelenléte biztosítja, hogy a tenyészet szaporodása közben a szükséges enzimek is képződjenek. 12 órai inkubálás után az elért baktériumszám és enzim-aktivitás már elegendő a biokonverziós reakció megindításához. Ekkor adjuk hozzá a gamma-ciklodextrinnel előkezelt szubsztrátot a következő módon : 100 g 5-pregnén-3p, 17a,21 -trihidroxi-20-on-21 - acetátot azonos mennyiségű gamma-ciklodextrinnel 200 cm3 vízben 20 percig homogenizálunk, ezalatt az átalakítandó szubsztrát arányos része gyorsan oldódó komplexet képez a ciklodextránnal. Az így kapott szuszpenziót betápláljuk a fermentorba, majd az inkubálást a kiindulási szteroid elfogyásáig folytatjuk, ami körülbelül 11 órát vesz igénybe. A laboratóriumi fermentorban az inkubálást 20 °C hőmérsékleten végezzük, percenként 420 fordulattal történő keverés és 0,5 liter/liter/perc levegőztetés mellett, miközben az átalakulást rétegkromatográfiai vizsgálattal ellenőrizzük. Az átalakítás végén a fermentlé szteroidtartalma: 9020 pg/cm3 4-pregnén-17a,21-dihidroxi-3,20- dion (Reichstein S), 30 pg/cm3 átalakulatlan kiindulási szteroid. Ciklodextrin hozzáadása nélkül ez a biokonverzió ugyanilyen körülmények között csak 10 g/liter kiindulási szteroid-koncentrációval lett volna lefolytatható. 4. példa Reichstein-S-17-acetát átalakítása hidrokortizonná Egy 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikban 100 cm3 tápközeget, amelynek összetétele: 1,0 súly% szójaliszt 0,3 súly% kukoricalekvár (50% szárazanyagtartalmú készítmény, szárazanyagra számítva) 0,3 súly% kukoricakeményítő 0,5 súly% malátakivonat (30% szárazanyagtartalmú folyékony készítmény, szárazanyagtartalomra számítva) pH = 6,2 beoltunk Curvularia prasadii (I.M.I. 71475) ferde agar-tenyészetéről lemosott spórák szuszpenziójával. A tenyésztést 26 °C hőmérsékleten 24 óra hosz-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
