190784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroid-vegyületek mikrobiológiai átalakításának intenzifikálására
1 190 784 2 nyös hatás, mivel ez a reakciósebesség növekedésében, az átalakítási idő csökkenésében nyilvánul meg, növelhető a szubsztrát koncentrációja a közegben, kiküszöbölhető a termékgátlás és a lehetséges reakciók közül a kívánt reakciót katalizálhatjuk, vagyis a mikrobiológiai reakció szelektivitását növelhetjük. A ciklodextrín szteroid-szubsztrát zárványkomplexek előállítása több változat szerint végezhető. Egyik változat szerint a biokonverzió közege a kívánt ciklodextrín megfelelő %-os koncentrációjú vizes oldata, ehhez adagoljuk a szubsztrát szteroidot, amikor a zárványkomplex az egyensúlyi helyzetnek megfelelő mértékben képződik. Más megoldás szerint a szteroid rendszerbe adagolásának kiiktatására külön elkészítik adagolótartályban a szubsztrátciklodextrin zárványkomplex vizes oldatát, amelyet szűréssel sterilezve adagolunk a biokonverziós közeghez. Kis mennyiségű víz jelenlétében a tapasztalat szerint a szteroid és a ciklodextrín keveréke átkristályosítható, szteroid-ciklodextrin komplex képződik, ami sterilezést nem igénylő biokonverziós folyamathoz szilárd formában adagolható. A ciklodextrinek természetes eredetű glukózpolimerek és az egyes ciklodextrín típusok 6, 7 illetve 8 glukózegységből felépülő zárt makrogyűrűk. A kötésjellegnek megfelelően nevezik a ciklodextrineket ciklo-amílózoknak is. Szteroidmolekulák ciklo(jextrinnel képzett komplexeit többféle gyógyszerhatóanyag és többféle szolubilizáló anyag tanulmányozása során Lech és Pauli szerzők (J. Pharm. Sei. 55, 32, 1966.) vizsgálták. Tesztoszteron és kortizonacetát esetében megállapították az összetevők valószínűsíthető sztöchiometrikus arányait. A szolubilizálásokkal a gyógyszerhatóanyagok felszívódását kívánták befolyásolni. Nem alkalmazták azonban a ciklodextrineket szteroidszubsztrátumok mikrobiológiai átalakításánál a reakciók intenzifikálására. Megállapítottuk, hogy a szteroid-szubsztrát ciklodextrinnel képzett komplexe vizes közegben pillanatszerűen disszociál és a biokonverziós rendszerben a komplex dinamikus egyensúlyban van a szabad szteroid és a szabad ciklodextrín molekulákkal. Szilárd, szuszpendált szteroidot tartalmazó biokonverziós rendszerben az enzim számára hozzáférhető oldott hányad mindenkori koncentrációja a felhasználó enzimes reakció sebességétől és az utánpótlást biztosító szubsztrát beoldódási sebességétől függ. Ha a beoldódás a lassúbb folyamat, akkor a szteroid oldat koncentrációja a reakció folyamán jóval a telítettségi érték alatt marad, ez a körülmény pedig - az enzimes reakció ismert alaptörvénye értelmében - a reakciót lényegesen lassítja. A ciklodextrinnel képzett zárványkomplexből a szubsztrát felszabadulása gyakorlatilag pillanatszerűen megy végbe, ezért ebben az esetben az oldott szubsztrát értéke a teljes folyamat során egészen a folyamat befejezéséig telítettségi értéken marad és ezzel biztosítja az adott enzimes reakcióra vonatkozó maximális átalakulási sebességet. Más szteroid átalakítási folyamatoknál a reakciótermék, az ún. végtermékgátlási mechanizmus szerint lassíthatja vagy leállíthatja a reakciót az enzim vagy a sejt felületéhez kötődve. Ugyanakkor a szubsztrát és a végtermékmolekulák szerkezeti eltéréseik miatt kisebb vagy nagyobb mértékben különböző stabilitású komplexet képeznek a ciklodextrinnel. Vizsgálataink szerint sikerült olyan kedvező reakciókörülményeket kialakítani, amelyben az egyébként végtermékgátlást okozó szteroidot viszonylag stabil ciklodextrin-komplex-szé alakítottuk át anélkül, hogy a szubsztrát szteroid hozzáférhetőségét rontottuk volna. Amikor a szubsztrátciklodextrin komplex stabilitása nagyobb mint a végtermék-ciklodextrin komplexé, akkor a komplexképződés kihasználásával a végtermékgátlás úgy függeszthető fel, hogy a ciklodextrín beadagolását csak a reakció bizonyos előrehaladása után végezzük, amikor a termékfelesleg a rendszerben kimutatható. További vizsgálatok során megállapítottuk azt is, hogy észterezett szteroidmolekulák enzimes hidrolízise meggyorsítható a megfelelő ciklodextrinkomplex előállításával. Ennek magyarázata feltehetően a ciklodextrín szerkezetéből adódó katalitikus hatás. Különböző biokonverziós átalakítások során megfigyeltük azt is, hogy a ciklodextrin-komplexek képzése más jellegű arányeltolódást is okozhat, így megfelelően stabil komplex esetében - a molekula hozzáférhetőségének csökkentésével - adott térhelyzetű reakció sebességét csökkenthetjük vagy azt ki is zárhatjuk. A ciklodextrinek zárványkomplexképző tulajdonsága és az így képzett zárványkomplexeknek a biokonverziós reakciókat intenzifikáló hatása különféle szteroidok széles körében érvényesül. Az alábbi példákban, amelyek a találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait szemléltetik közelebbről, androsztán, pregnán, kolesztán, sztigmasztán és kardenolid típusú szteroidok esetében szemléltetjük a ciklodextránnal történő zárványkomplex-képzésnek a szteroid különféle mikrobiológiai átalakítása során mutatott hatását. Megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre semmilyen szempontból sincs e konkrét példákra vagy az azokban szereplő szteroidokra, illetőleg a bemutatott reakciókra korlátozva. 1. példa Hidrokoríizon átalakítása prednizolonná Arthrobacter simplex (ATCC 6946) agar-tenyészetéről fiziológiás nátrium klorid-oldattal lemossuk a sejteket és az igy kapott sejtszuszpenzió 5 emsével beoltjuk a következő összetételű, előzetesen 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett tápközeget : 0,3% glükóz 0,1% élesztőkivonat (szárazanyagra számítva, porlasztással szárított poralakú készítmény), 0,5% enzimesen hidrolizált kazein (porlasztással szárított poralakú készítmény) vízzel 100 cm3-re kiegészítve, pH = 6,7. A tenyésztést 32 °C-on, percenként 230/perc löketszámú sík rázógépen 18 órán át folytatjuk, majd 5 mg hidrokortízon 0,5 cm3 metanollal készített 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
