190701. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált imidazo [1,5-a] piridin-származékok és e vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
7 190701 8 szcintillációs küvettákba visszük át és a beütésszámokat leszámláljuk. A TxBi/PGFi/*(L beütésszámhányadost a vizsgálandó vegyület minden koncentrációjára kiszámítjuk és az ICso értékeket grafikusan határozzuk meg (IC = »inhibiting concentration"). Ez az érték a tesztvegyület azon koncentrációja, amelynél a TxBi/PGFa&jb hányados a kontrollérték 50%-ára csökken. A prosztaglandin-ciklooxigenázra gyakorolt in vitro hatást Takeguchi és munka-társai módosított eljárásával (Biochemistry 10, 2372 /1971/) állapítjuk meg. A próba menete a következő: Kos-ondóhólyag mikroszóma-frakciót használunk enzimkészítményként a proszlagland in-szintézishez. MC-arachidonsavnak PGEí-vé történő átalakulását mérjük. A tesztvegyületeket (pufferban, vagy szükség esetén kevés etanolban oldva) hozzáadjuk az inkubációs keverékhez. A prosztaglandinokat extraháljuk és vékonyrétegkromatográfiával szétválasztjuk. A lemezeket detektálva a PGEï-nek megfelelő radioaktív zónákat folyadékszcintillációs küvettákba visszük át és radioaktivitásukat lemérjük. A gátlás ICso koncentrációit grafikusan határozzuk meg. Ez az érték a vizsgált vegyület azon koncentrációja, amely a szintetizált PGEi mennyiségét 50%-kal csökkenti. A prosztaciklin-(PGIí)-szintetázra kifejtett in vitro hatást Sun és munkatársai módszerével (Prosztaglandins 14, 1055 /1977/) állapítjuk meg. Az eljárás a következő: uC-arachidonBavat enzimkeverékkel inkubálunk, amely kos-ondóhólyag ból nyert, szolubilizált és részlegesen tisztított prosztaglandin-ciklooxigenázból és marha-aorta mikroszóma-frakciójában jelenlévő nyers PGIi-szintetázból áll. A vizsgálandó vegyületet (pufferban, vagy szükség esetén kevés etanolban oldva) az inkubációs közeghez adjuk. A reakciókeveréket 100 millimoloB trisz-HCl (pH 7,5) pufferban 30 percig 37 ®C-on inkubáljuk, pH 3-ig megsavanyítjuk és etil-acetáttal extraháljuk. A kivonatot szárazra pároljuk, a maradékot acetonban oldva vékonyréteglemezre felvisszük és a Sun és munkatársai által leírt oldószerrendszerrel kromatografáljuk. A radioaktív zónákat detektor segítségével lokalizáljuk. A 6-keto-PGFi^ (a prosztaciklin biotranBzformációjának egy stabil végterméke) és a PGE2 zónáját lekaparva folyadékszcintillációs küvettába visszük át és leszámláljuk. A 6-keto-PGFj^PGEi beütésszám-hényadost a tesztvegyület minden koncentrációjára kiszámítjuk. A gátlás ICso-értékét grafikusan kapjuk meg. Ez az érték a tesztvegyület azon koncentrációja, amelynél a 6- -keto-PGFuVPGEa hányados a kontrollérték 50%-ára csökken. A tromboxán-plazmaszint csökkenését in vivo határozzuk meg a vizsgálandó vegyülettel tongerimulacokat kezelve az alábbiak szerinL: Tengerimalacokat a tesztvegyülettel vagy hordozóanyaggal kezelünk és 2 óra múlva az állatoknak intraperitoneálisan arachidonsavat (40 mg per kg) fecskendezünk be. Az arachidonsav beadása után 1 óra múlva az állatoktól vért veszünk. Minden plazmapróba meghatározott mennyiségéből meghatározzuk a tromboxán B2-I és további mennyiségekből a 6-keto-PGFv-t, a tromboxán fia stabil melabolitjait illetve a prosztaciklint (PGI2). Az (I) általános képletü vegyületek nagyon hatásos tromboxán-szintetáz-inhibitorok. Hatékony dózisszinteknél és ezek felett sem a hasznos prosztaciklin-szintetáz, sem a prosztaglandin-ciklooxigenáz enzimrendszer nem gátlódik. A találmány szerinti vegyületek, pédául az 5-(5-karboxi-penlil)-imidazo[l, 5-alpiridin ICso-értéke 3.10-9 mól a tromboxán-szintetáz gátláshoz, míg a prosztaciklin-szintetáz és a prosztaciklin-ciklooxigenáz gátlásának ICso-értéke nagyobb 1.10”® mólnál. A találmány szerinti vegyületek, például az 5-{5-karboxi-pentil)-imidazo[l, 5-alpiridin a tromboxán B2 plazmaszintjét is több mint 50%-kal csökkenti tengerimalacnál alacsony, 0,25 mg/kg orális dózisnál. Ilyen vagy ennél magasabb orális dózisoknál a prosztaciklinek semmilyen jelentős csökkenése nem figyelhető meg. Az említett előnyös tulajdonságaik alapján a találmány szerinti vegyületek emlősök számára - beleértve az embert - igen értékesek mint BpecifikuB gyógyszerek, (gy például tromboembóliánál a tromboxán-szintetáz enzim ezen specifikus gátlása csökkenti az arachidonsavval indukált vérlemezke-aggregációt, ami véralvadékok képződésénél szerepet játszik. Kísérletesen patkánynál a vérzésidő meghosszabbodásét a kedvező trombózis-ellenes hatás jeleként tekintjük. A találmány szerinti imidazofl, 5-a]piridinek meghosszabbítják a vérzési időt. (gy például az 5-(5-karboxi-pentil)-imidazon, 5-a]-piridin ezt a hatást patkánynál mintegy 1 mg/kg dózisnál és ez alatt fejti ki. A légzési zavarokra gyakorolt kedvező hatásokra az a tény utal, hogy a találmány szerinti vegyületek védelmet nyújtanak az arachidonsavval kiváltott tüdőelzáródás miatt bekövetkező hirtelen halál ellen. így például az 5-(5-karboxi-pentil)-imidazo[l, 5-a]piridin az egeret megvédi a hirtelen haláltól 100 mg/kg orális dózis beadásánál. A találmány szerinti vegyületek önmagukban ismert módszerekkel, előnyösen úgy állíthatók elő, hogy a) egy (VI) általános képletü vegyületet - ahol M alkálifématomot, R2 hidrogénatomot vagy 1-4 szénatomszámú alkilcsoportot jelent - egy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
