190680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6"-O-karbamoil-tobramicin előállítására mikrobiológiai úton
2 190680 3 A találmány tárgya eljárás 6"-0-karbamoil-tobramicint tartalmazó ferraentlevek előállítására mikrobiológiai úton. Ismeretes, hogy a Streptomyces tenebrarius több komponensből álló, nebramicinnek elnevezett antibiotikum-keveréket bioszintetizál (Stark, Hoehn és Knox, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, 314. oldal; 1 178 489 számú nagy-britanniai és 3 691 279 Bzámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az antibiotikum-keverék több minor komponens mellett nebramicin-2 (apramicin), nebramicin-4 (6”-0-karbamoil-kanamicin B) és nebramicin-5’ (6”-0-karbamoil-tobraraicin) major komponenseket tartalmaz (Koch, Davis és Rhoades, J. of Antibiotics, 26, 745, 1973). A 3 853 709 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a szerzők nebramicin-2 mellett nebramicin-7-et termelő mikroorganizmust írnak le. Japán szerzők a 4 032 404 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Streptoalloteichus hindustanus tórzB tenyésztésével oldják meg a nebramicin-2 és nebramicin-5' együttes előállítását. A 176 103 számú magyar szabadalmi leírás szerint eljárva a Streptorayces tenebrarius MNG 169 és 170 sorszámú törzsek süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények közötti tenyésztésével sorrendben nebramicin-2-t, nebramicin-4-et és nebraraicin-5’-t, illetve nebramicin-2-t és nebramicin-5'-t tartalmazó fermentleveket kapnak. Ezekből az antibiotikumokat a 174 315 számú magyar szabadalmi leírás szerint izolálják. A nebramicin-2 növényi és állati megbetegedéseket okozó mikroorganizmusok növekedését gátolja (3 691 279, 3 853 709 és 3 876 763 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások), a nebramicin-4 hidrolízisével előállított kanamicin B és elsősorban a nebramicin-5’ hidrolízise után kapott tobramicin (Brulamycin) pedig forgalomban lévő Bzélesspektrumú, polirezisztens baktériumok okozta fertőzések leküzdésében jelentős szerepet játszó, a hufnán terápiában használt antibiotikumok (például Preston és Wick, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1970, 322. oldal). A 176 103 számú magyar szabadalmi leírás szerint eljárva az 1. táblázatban megadott összetételű antibiotikum-keveréket kapjuk: 1. táblázat Törzs Nebra-Nebra-Nebramicin-2 micin-4 micin-5’ MNG 169 77 2 21 MNG 170 91 nyomokban 9 Látható, hogy a törzsek túlnyomó részben nebramicin-2-t bioszintetizálnak. A nebramicin-5’-t a túlsúlyban lévő egyéb komponensektől bonyolult és költséges eljárással különítik el. Egy mikroorganizmus által bioszintetizált antibiotikum-komplex összetételét döntően a sejt genetikai információ-készlete határozza meg, kisebb részben a fermentációs körülmények. Az iBmert eljárásokkal, ha nebramicin-5’-t kívánnak termelmi, úgy azt költséges eljárásokkal kell elkülöníteni a túlsúlyban lévő nebramicin-2-tól. A törzsek termelőképességének foko-zását célzó törzsnemesítési kísérletek kiértékelése a többkomponensű rendszereknél munka- é3 időigényes. A komponensek mennyiségét vékonyréteg-kromatográfiás elválasztásukat követően külön-külön, biológiai értékméréssel határozzák meg. Előnyös lenne a törzsnemesítési kísérleteket egyszerű mérést megengedő egykomponensű rendszerrel végezni. Másrészt az egyetlen antibiotikumot termelő mikroorganizmus termelőképességének fokozódása valószínűbb, hiszen a sejtek teljes bioszintetikus kapacitásukat egyetlen vegyület felépítésére fordítják. A találmány célja olyan új és egyszerűen kivitelezhető fermentációs eljárás kidolgozása, amellyel gyakorlatilag csak nebramicin-5’-t tartalmazó fermentlevek állíthatók elő. Kísérleteink során megfigyeltük, hogy a Str. tenebrarius MNG 169 törzsből etidium-bromidos (2,7-diamino-lo-etil-fenil-fenantridium-bromid) kezelést követően, meglepő módon nebraraicin-2-t egyáltalán nem, nyomnyi mennyiségű nebramicin-4-et, és főkomponensként nebramicin-5’-t bioszintetizéló törzs izolálható. A jelenség annál is inkább váratlan és meglepő, mert az etidium-bromidot nem használják mutációt kiváltó szerként. A 176 103 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetetthez képest megváltozott komponensösszetételű antibiotikum keveréket bioszintetizáló sejtek izoláláséra a Streptomyces tenebrarius MNG 169 törzs spóráit folyékony halmazállapotú táptalajban tenyésztettük. A tenyészetet kinövése után öt részre osztottuk és 0, 0,05, 0,5 5,0 illetve 50,0 jug/ml etidium-bromidot adagoltunk hozzá. 24 órán át folytattuk a tenyésztést, majd megfelelő hígítást követően a tenyészetek egy részét agarlemezekre szólesztettük, másik részével pedig azonos mennyiségű etidium-bromidot tartalmazó folyékony halmazállapotú táptalajokat oltottunk. Ezeket 24 órán át ismét tenyésztettük, majd fentiek Bzerint megismételtük a szólesztést és a továbboltást. Az új folyékony halmazállapotú tenyészeteket 24 óra múlva ismét szélesztettük. Az agarleciezeket inkubéltuk, majd több különálló telepet izoláltunk és termelőképességüket a példákban ismertetett módon vizsgáltuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
