190680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6"-O-karbamoil-tobramicin előállítására mikrobiológiai úton
4 190680 5 A Streptomyces tenebrariuB MNG 169-ból származó több száz vizsgált izolátum közül két törzs nebramicin-2-t nem, nebramicin-4- -et nyomokban, nebramicin-5’-t pedig viszonylag kis mennyiségben termelt. A nebramicin-5’-t termelő két törzs termelőképességének fokozására törzsnemesítési és táptalajoptimalizálási kísérleteket végeztünk. Ezek során az egyik elpusztult, a másik termelőképessége viszont többszörösére fokozódott éB ezt a szintet stabilan megtartotta. A törzset letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzetközi Törzsgyűjteményében, ahol az MNG 204 sorszámot kapta. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás nebramicin-5'-t (6”-karbamoil-tobramicint) tartalmazó fermentlevek előállítására, amely abban áll, hogy az új Streptomyces tenebrarius MNG 204 sorszámú törzset szerves szén és nitrogénforrást, szervetlen sókat, nyomelemeket, állati és/vagy növényi eredetű, olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, 33 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 37 °C-on tenyésztjük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy az új Streptomyces tenebrarius MNG 204 sorszámú törzset, vagy ennek egy mutánsát vagy variánsét tenyésztjük. A mikroorganizmosok tenyésztését szerves szénforrást, például keményítőt, glicerint, fruktózt vagy más hasonló vegyületeket, előnyösen glükózt; szerves nitrogénforrást, például földimogyorólisztet, kukoricalekvárt, peptont, élesztőkivonatot vagy más hasonló készítményeket, előnyösen Bzójalisztet, kazeint, aminosavakat, előnyösen glutaminsavat; szervetlen nitrogénforrást, előnyösen ammóniumkloridot, ammóniumnitrátot és ammónium-Bzulfátot, szervetlen sókat, előnyösen magnézium-szulfátot, cink-szulfátot, kobaldnitrátot és kalcium-karbonátot; állati és/vagy növényi zsírokat és/vagy olajokat, például pálmaolajat, lenolajat napraforgóolajat, repceolajat, disznózsírt vagy másokat, előnyösen pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegyét, és a mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez elengedhetetlenül szükséges nyomelemeket tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között a mikroorganizmus növekedését biztosító 33 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten előnyösen 37 °C-on addig végezzük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum nem halmozódik fel. A nyomelemeket az egyéb táptalajösz- Bzetevők általában szennyezőanyagként tartalmazzák, de külön is hozzáadhatjuk a táptalajhoz. Az átáramoltatott levegő mennyiségét a táptalaj összetétele, a keverő hatásfoka és a fermentor műszaki adatai alapján kell megválasztani. Általában előnyős, ha a sejtek oxigénellátását úgy állítjuk be, hogy az elmenő gázelegy COj-tartalma ne emelkedjen 1,0% fölé és a táptalajból a redukáló cukor a 96. és a 110. óra között fogyjon el. A táptalaj Bterilezését 30-60 percen át 121-123 °C hőmérsékleten gőzzel végezzük. A táptalaj ph-ját sterilezés előtt 7,2-7,4 közötti értékre célszerű beállítani. A fermentáció közben habzésgátlót nem kell adagolnunk, mivel a tápanyagforrésként adagolt növényi vagy állati zsírok vagy olajok egyúttal a tenyészet habzésát is gátolják. A tenyésztés történhet lombikban, laboratóriumi, kísétleti üzemi vagy üzemi fermentorokban. A tenyészetek antibiotikum komponens-összetételét szilikagél vékonyréteg-kromatográfiát követően bioautográfiával határozzuk meg. A szilikagél (Merck, Darmstadt) vékonyrétegre 0,1-0,5 jug/ral közötti mennyiségű antibiotikumot cseppentünk, majd futtatóelegyként etil-alkohol, metil-etil-keton és 25%-os ammónium-hidroxid 1:1:1 arányú elegyét használva kromatografálunk. A gél teljes száradása után Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmust tartalmazó táptalajt rétegezünk a lemez felületére, és 37 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk. Ezután standarddel összehasonlítva meghatározzuk a gétlási zónák nagyságét. A mérés mennyiségi és minőségi kiértékelésre alkalmas, pontossága ±10 %. A fermentáció során a táptalajban 2100- -2600 jug/ml nebramicin-ö’mellett, a tenyésztés paramétereitől függően 10-180 pg/ml nebramicin-4 halmozódik fel. A tenyészetből a nebramicin-5’-t egyetlen kromatográfiás lépésben választjuk el a nebramicin-4-tól és a szennyező anyagoktól, majd ismert módon tobramicinné hidrolizáljuk. Eljárhatunk oly módon is hogy a nebramicin-5’-t a tenyészetben alakítjuk át tobrámicinné, és ezt különítjük el (174 315 sz. szabadalmi leírás ). A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a gyakorlatilag egyetlen komponenst termelő Str. tenebrarius MNG 204 törzzsel a korábbinál magasabb termelési szint érhető el. A törzzsel végzendő további törzsnemesítési kísérletek gyors eredményt ígérnek, hiszen a sejt teljes bioszintetikus kapacitását egyetlen antibiotikum előállítására fordíthatja. Az egyetlen antibiotikum-komponenst tartalmazó fermentlevek aktivitásának meghatározása gyors, egyszerű és pontos, a hatóanyag elkülönítése nem igényel költséges tisztítást. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbiakban kiviteli példákkal részletesen szemléltetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
