190491. lajstromszámú szabadalom • Eljárás detoxikált endotoxin előállítására
1 190 491 2 ra, majd az anyagot ultrahanggal kezeljük, végül Whatman No. 1 szűrőberendezésen szűrjük 5 °C hőmérsékleten. Ily módon szárítás után 100 mg nyers detoxikált endotoxint nyerünk. 2. példa Nyers, detoxikált endotoxin előállítása 120 mg 1. példa szerinti metanol-kloroform precipitátumot (MCP) 120 ml abszolút metanolban szuszpendálunk, ultrahanggal diszpergáljuk, majd az így nyert anyagot 6 db csavaros fedelű üvegfiolába (1 x 10 cm) helyezzük. Mindegyik fiolába ezután 2 ml 0,2 n sósavat adunk és a kapott szuszpenziót 45 percen keresztül fövő vízfürdőn inkubáljuk. A hidrolízis befejeződése után a csöveket jégfürdőn lehűtjük, 10 percen át 2500 ford/perc-nél centrifugáljuk, majd a felüllevő folyadékot dekantálva az üledéket 5 ml 2:1 arányú kloroform/metanolelegyben oldjuk. Ezután minden edénybe 2 ml vizet adagolunk, jól elkeverjük és a kétfázisú keveréket 10 percen keresztül 2500 ford/perc-nél ismét centrifugáljuk. Centrifugálás után a felső vizes részt eldobjuk és a maradékhoz 1-1 ml 4 : 1 arányú kloroform/metanol elegyet adunk. Az így nyert tiszta oldatokat egyesitjük és az oldószert eltávolítjuk. A maradékot nagyvákuumban szárítjuk, és liofilizáljuk. Ily módon 45 mg nyers A lipidet nyerünk, amelyből 20 mg-ot 0 °C-os acetonban oldunk, és ultrahangos kezelés, majd Whatmann No. 1 szűrőberendezésen való szűrés után 13 mg nyers, detoxikált endotoxint nyerünk. 3. példa Tisztított, detoxikált endotoxin előállítása 110 g LH-20-100-at (részecskeméret: 25-100 mikron, Pharmacia) 600 ml 2:1 arányú kloroform, metanol eleggyel egyesítünk, és 30 percen át állni hagyjuk. A kapott iszapot ezután 25 x 1000 mm méretű, nyomás alatt töltött kromatografáló oszlopra (BRI. Laboratories) adjuk fel, amelyet nyomásálló tefioncső segítségével egy ISCO Model 132 típusú szivattyúhoz csatlakoztatunk. Ennek segítségével 400 ml 4:1 arányban elegyített kloroform./ metanol elegyet (3 ml/'perc sebességgel), majd 2,5 ml 4:1 arányú kloroform/metanol elegyben oldott 100 mg 1. példa szerint előállitott endotoxint engedünk át az oszlopon, melynél a folyási sebességet 1 ml/perc-re csökkentjük. 150 ml eluáló anyag öszszegyűjtése után az elfolyó anyagot egy frakciógyűjtőhöz csatlakoztatjuk, és 4 ml-es frakciókat gyűjtve, a tisztított detoxikált endotoxin frakciókat vékonyréteg kromatográfiával vizsgáljuk (E. Merck, 0,25 mm-es réteg, eluáló anyag kloroform/ metanol/ammónium-hidroxid/víz 50:25:2:4 arányú elegye). A tisztított, detoxikált endotoxin frakciókat ezután összegyűjtjük, és az oldószer eltávolítása után 30 mg tisztított, detoxikált endotoxint nyerünk, fehér por formájában, amelynek foszfortartalma: ~390 nmól/mg (meghatározás: O. H. Lowry és mtársai: J. Bioi. Chem. 207, /1954/, 1), zsírsavtartalma: ~ 1850 nmól/mg (meghatározás: E. Ribi és mtársai: Cancer Immunoi. Immunother. 12, /1982/, 91), 2-keto-3-dezoxi-oktanoát: 0 (meghatározás: Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 50 11963/, 499), CELDS0 (Chick Embryo Lethal Dose - 50%) : > 10 Összehasonlításul megadjuk egy toxikus endotoxin megfelelő értékeit : foszfortartalom: ~ 1050 nmól/mg zsírsavtartalom: ~1820 nmól/mg 2-keto-3-dezoxi-oktanoát: ~ 1130 nmól/mg CELD50 : 0,026 4. példa Tisztított, detoxikált endotoxin készítése 33 g DEAE-cellulózt (Whatmann DE-32) 150 ml jégecettel 10 percen keresztül enyhén keverünk, majd az így kapott iszapot egy éjszakán át állni hagyjuk. Ezután az iszapot 25 x 400 mm-es oszlopba öntjük, ütögetéssel ülepítjük, majd a felesleges savat leszívatjuk. Az oszlopot ezután 2000 ml metanollal, majd 200 ml kloroform/metanol 4:1 arányú elegyével átmossuk, majd 100 mg az 1. példa szerint előállított nyers detoxikált endotoxin 3 ml 4:1 arányú kloroform/metanol, vagy 80:20:1 arányú kloroform/metanol/víz eleggyel készült oldatát engedjük át az oszlopon. Eluálószerként 350 ml 4:1 arányú kloroform/metanol elegyet, majd 300 ml 99:1 arányú metanol/víz elegyet alkalmazunk. Amennyiben lineáris elrendezésű készüléket használunk, az eluálást 100%-os metanollal kezdjük, majd utána 0,2 mól ecetsavat tartalmazó metanol oldattal fejezzük be. Az eluálást 6 ml/perc sebességgel végezzük és 15 ml-es frakciókat gyűjtünk. Minden frakciónál meghatározzuk a foszfortartalmat, az analízist Bartlett G. R. módszere szerint végezve (J. Bioi. Chem. 234, /1959/, 4666-471). Az egyes frakciókat összegyűjtjük, közel szárazra töményitjük. Az így kapott anyagot választótölcsérben 10 ml 2:1 arányú kloroform/metanol elegyben és 40 ml 0,001 mólos ecetsavban felvesszük, az alsó réteget elválasztjuk, Whatman No 2-es szűrőpapíron szűrjük, végül szárazra pároljuk. Ily módon 19,2 mg tisztított, detoxikált endotoxint nyerünk, amelynek foszfortartalma: 430 nmól/mg zsírsavtartalma: 1900 nmól/mg, 2-keto-3-dezoxi-oktanoát: 0 CELDS0: > 10. 5. példa 13 tengerimalac (2. törzs) 9 mm-es daganatában (Line-10) közvetlen injekciózással 50 pg RDE-t és 50 pg CWS-t tartalmazó 0,4 ml steril olajszuszpenziót (Drakeol 6 VR ásványi olaj, gyártó: Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania) adagoltunk. Három hónap elteltével megvizsgáltuk az állatokat, és a 13 közül 12-nél a daganatok teljes visszafejlődését állapítottuk meg. A kontroli-vizsgálatnál 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
