190491. lajstromszámú szabadalom • Eljárás detoxikált endotoxin előállítására
1 190 491 2 rős oszlopon - az RDE frakciók szétválasztása érdekében átengedjük, majd az oldószer eltávolítása után a frakciókat egyesítjük. Egy másik megvalósítási formánál, a nyers detoxikált endotoxint oldószer, így például kloroform, metanol, aceton, piridin, éter, ecetsav vagy ezek keverékének jelenlétében, Sephadex töltetű oszlopon engedjük át. Az oszlop nyomása különböző lehet, előnyösen azonban atmoszférikus és 6,89-105 Pa közötti érték, az átfolyási sebesség 0,1-10 ml/perc. Egy másik megvalósítási formánál a nyers detoxikált endotoxin oldatot a fentiekben megadott nyomásviszonyok között DEAE-cellulóz töltetű oszlopon engedjük át, 2-15 ml/perc sebességgel. Az alkalmazott oldószerek ugyanazok lehetnek, mint amelyeket a Sephadex oszlopnál alkalmazunk, de bármelyikhez még vizet és/vagy dietil-amint is adagolhatunk 1% mennyiségig. Egy következő módszer a tisztított detoxikált endotoxin előállítására, amikor a nyers detoxikált endotoxint alacsony nyomású szilikagél-60 oszlopon kromatografáljuk - a szilikagél szemcsemérete 15-63 mikron közötti - és az alkalmazott oldószer kloroform, metanol, víz vagy ammónium-hidroxid, előnyösen ezek 50:25:4:2 térfogatarányú keveréke. A találmány szerinti eljárással előállított RDE-t CWS-el kombinálva nagyhatású tumor-ellenes készítményt nyerünk. Ezt a készítményt alkalmazhatjuk állatok rákos daganatainak kezelésére, így például szarvasmarháknál pikkelyes sejt-szarkóma, fibroszarkóma, lovaknál daganatok, melanoma, pikkelyes sejt-szarkóma, kutyáknál emlő- és mirigydaganatok és melanoma, valamint embereknél mell-, tüdő- és végbéldaganatok, rosszindulatú melanoma, pikkelyes sejt-szarkóma és petefészekdaganatok kezelésére. A készítményeket előnyösen közvetlenül a daganatba injekciózva adagoljuk. Az injekciókat gyógyászatiig elfogadható anyagokkal, például olajos emulzió formájában készítjük. Az említett készítményeket liofilizálással stabilizálhatjuk is, és regenerálhatjuk anélkül, hogy azok aktivitásukból veszítenének. Az RDE mennyisége az egyes injekciókban állatok esetén 6,26-250 pg/ml, a CWS mennyisége 125-750 pg/ml. A daganatba beinjekciózható mennyiséget a daganat nagysága szerint határozzuk meg, az alábbi táblázat alapján: Alkalmazható dózisok állatoknál a daganat nagyságától függően Daganat átmérője (cm) Injekció mennyisége 0-1 cm 0,5 ml-ig 1-2 cm 0,5-2,5 ml-ig 2-3 cm 2,5-5 ml-ig 3-5 cm 5-10 ml-ig 5-8 cm 10-15 ml-ig nagyobb mint 8 cm 15-20 ml-ig Az egy injekcióban levő maximális dózis 1500 pg RDE és 4500 pg CWS lehet. Az RDE-CWS készítményeket alkalmas injekció formájában, mint például az olajos emulzió, embereknél is közvetlenül a daganatba injekciózzuk. Humán alkalmazásnál az egyes injekciók 50-1000 pg, előnyösen 275-325 pg RDE-t ill. CWS-t tartalmaznak átlagos 70 kg testsúlyú felnőtt ember esetében. Az injekciózást hetente egyszer végezzük, és maximum 15 injekció adható. Általában az a kívánatos, hogy a készítmények 50 és 500 pg/ml RDE-t és 50 és 500 pg/ml CWS-t tartalmaznak injekciónként. Mint a fentiekben említettük, melegvérű állatok és emberek kezelésénél a találmány szerinti készítményeket olajos emulzió formájában alkalmazhatjuk. Ezeknél az olaj mennyisége általában 0,5-3,0 térf.% - előnyösen 0,75-1,5 térf.% - a kompozíció teljes mennyiségére számítva. Az emulziókban például könnyű ásványi olajakat, 7-n-hexil-oktadekánt, Conoco-szuper-ólajat és Drakeol 6 VR ásványi olajat (gyártó Pennreco Company, Bulter, Pennsylvania) használhatunk. A homogenizált, olajtartalmú keverékeket tisztító (detergens) anyagokkal keverjük el, amelyeket adott esetben előbb sóoldatban oldunk. A detergensek mennyisége 0,02-0,20 térf.%, előnyösen 0,1-0,20 térf.% a készítmény teljes térfogatára számítva, és e célra bármely ismert detergens hatású anyag használható, így például Tween-80 és Arlacel (gyártó Atlas Company Chemical). A detergens anyag hozzáadása után a keveréket homogenizáljuk, így olyan szuszpenziót kapunk, amelyek RDE-vel és CWS-el burkolt olaj-cseppeket tartalmaznak, amit mikroszkóp alatt jól megfigyelhetünk. A következő példákkal csak illusztráljuk és semmiképpen sem korlátozzuk csak azokra a találmány szerinti eljárást. 1. példa Nyers, detoxikált endotoxin előállítása 650 g, Chen és mtársai. (J. Infect. Dis. 128,/1973/ 543) módszere szerint előállitott metanol-kloroform precipitátumot 150 ml 0,1 n sósavban szuszpendálunk háromnyakú, kondenzálóval ellátott lombikban, majd ultrahangos berendezésbe helyezzük. Az ultrahangos kezelés után az üvegkészüléket 120°-os olajfürdőn addig melegítjük, amíg a belső hőmérséklet az oldat forráspontját eléri. A túlmelegedés elkerülése érdekében a lombikba kapillárison keresztül, a hidrolízis folyamata alatt folyamatosan nitrogéngázt vezetünk. A hidrolízist 30 percen keresztül végezzük, az oldatot jégfürdőn lehűtjük, a szilárd anyagot ultrahanggal diszpergáljuk, majd korex-csőben szétoszlatjuk. A lombikot desztillált vízzel kimossuk, hogy a falra tapadt szilárd anyagot is eltávolítsuk, amelyet ezután szintén a centrifugáló csőben levő szuszpenzióhoz adunk. A centrifugálást 12000 ford/ perc-en végezzük 30 percen keresztül, majd ezután az üledéket desztillált vízben reszuszpendáljuk, ultrahanggal jól diszpergáljuk, majd ismét centrifugáljuk. Az üledéket desztillált vízben felvesszük, így fagyasztás és liofilizálás után 382 mg nyers A lipidet nyerünk. Ebből az anyagból 150 mg-ot 0 °C hőmérsékletű acetonban oldunk a zsírsavak eltávolításá5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
