190491. lajstromszámú szabadalom • Eljárás detoxikált endotoxin előállítására
1 190 491 2 A találmány tárgya eljárás tisztított, detoxikált endotoxin (refined detoxified endotoxin RDE), valamint ilyent sejtfal-vázzal (cell wall skeleton, CWS) kombináltan tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. Ezek a készítmények hatásosak rákos daganatok kezelésénél, az endotoxin egyébként ismert káros mellékhatása nélkül. A találmány szerinti eljárással előállított RDE-ra jellemző, hogy 350 és 470 nmól/mg közötti foszfor- és 1700 és 2000 nmól/mg közötti zsírsav-tartalomnál kimutatható 2-keto-3-dezoxi-oktanátot nem tartalmaz. Az Enterobacteriaciae törzsből - beleértve az anya-, valamint a mutáns törzseket is - nyert endotoxin extraktumok ismertek, és immunogén daganatok immunterápiájában alkalmazzák őket (1. Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxin, Ribi ésmtársai, Cancer Immunol. Immunother., 7, /1979/, 43-58). Ismert azonban az is, hogy ezek mérgező hatásúak, így alkalmazásuk rákos daganatok kezelésében korlátozott. Történtek ugyan kísérletek az endotoxin detoxikálására, úgy hogy daganat-visszafejlesztő hatásukat megtartsák, de mint azt Ribi és mtársai kimutatták, az alkalmazott kémiai kezelések - mint a szukcinálás és ftálozás - egyaránt csökkentették az endotoxikus és tumor visszafejlesztő hatást is. így eddig még nem ismert olyan eljárás, amellyel tumor visszafejlesztő és nem mérgező endotoxin lenne előállitható. A sejtfal-váz lényegében olyan sejtfal, amelyből a sejtfalakban egyébként jelenlevő proteinek és lipidek legnagyobb részét eltávolították. Anyagukat tekintve polimer mikolsav arabinogalaktán mikopeptidek, amelyek trehaloz-mikolát-maradékot ("P3") és emésztetlen tuberkulo-proteint tartalmaznak. A sejtfal-vázat bármelyik a következőkben felsorolt mycobaktérium törzsből előállíthatjuk anélkül, hogy az előállítást ezekre korlátoznánk: M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheríae, Corynebacterium parvum, M. kansasii, M. tuberculosis(H 37 RV és Ayoma B törzsek), és M. bovis BCG törzs. Továbbá előállíthatjuk a sejtfal-vázat az E. coli, B. abortus és Coxiella burnettii törzsekből is, amelyek nem Mycobacterium törzsek. A sejtfal-váz előállításánál először tenyésztjük - például M. bovis BCG törzsből (Calmette-Guerin bacillus) -, majd összegyűjtjük a baktériumokat és a kapott teljes sejteket sejt-frakcionálóba helyezzük (Ribi Cell Fracionator /Sorvall, Model RF-1 /), amely szétzúzza a sejteket és elválasztja a sejtfalakat a protoplazma szennyeződésektől. Az így nyert sejtfalakat ezután különböző oldószeres extrakcíónak és enzimatikus kezelésnek vetjük alá (például tripszin és/vagy kimotripszin) a tisztított sejtfalváz előállítása érdekében. A találmány tárgya ezek alapján tisztított detoxikált endotoxin előállítása, amelynek tumor-visszafejlesztő hatása igen nagy az endotoxin egyébként ismert mellékhatása nélkül, továbbá eljárás tisztított detoxikált endotoxint sejtfal-vázzal kombináltan tartalmazó nagyhatású rákos daganatok kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására. A találmány szerint előállított RDE nem tartalmaz kimutatható 2-keto-3-dezoxi-oktanátot 350 és 475 nmól/mg közötti foszfor- és 1700 és 2000 nmól/ mg közötti zsírsav tartalomnál. Az RDE előállításához kiindulási anyagként alkalmazott endotoxin extraktumot bármely Enterobacteriaciae törzsből előállíthatjuk, beleértve az anya és mutáns törzseket is. Példaképpen a következő mikroorganizmus nemzetségeket soroljuk fel : Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella és Serratia. Jellemzően a következő fajokat alkalmazzuk: S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni és S. abortus equi. A kiindulási anyagként alkalmazott endotoxin extraktumot különböző ismert eljárások valamelyikével állíthatjuk elő (lásd például Webster, M. E., Sagin, J. F., Landy, M., és Johnson, A. G., J. Immunoi. 744 /1955/, 55; Westphal, O., Luderitz, O., és Bister, F., Z. Naturforsh, 76, 148 /1952/; Westphal, O., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference /George F. Springer kiadásában/, Madison, N. J. Madison Printing Co., 1957, 115; Galanos, C, Luderitz, O,, Westphal, O., Eur. J. Biochem. 9, 245 /1969/; Chen, C. H., Johnson, A. G., Kasai, N., Key, B. A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Dis. 128 543 /1973/; Ribi, E., Haskins, W. T., Landy, M., Milner, K. C, The Journal of Experimental Medicine 114 647 /1961/; Leive, L,, Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 290 /1965/; és Ribi, E., Milner, K. C, és Terrine, T., J. Immunoi. 82 75 /1959/). Az endotoxin extraktum előállításának előnyös módszere a Chen és munkatársai szerinti metanolkloroformos kicsapásos módszer. A metanol-kloroformos precipitátumot (MCP) szerves vagy szervetlen savval reagáltatjuk, majd liofilizáljuk. Az így nyert hidrolizált nyers A lipid mérgező és lázkeltő hatása kisebb, mint a kiindulási endotoxin anyagé. Ezt a terméket ezután olyan oldószerrel kezeljük, amely a zsírsavakat és egyéb szennyeződéseket oldja anélkül, hogy a nyers A lipidet is feloldaná. Ilyen oldószer előnyösen az aceton. A detoxikált, tisztított A lipid foszfor-tartalma körülbelül a fele a toxikus megfelelőjének. Ez arra utal, hogy az endotoxin mérgező hatásáért a foszfortartalom a felelős. Az MCP kezelésére előnyös szervetlen oldószerként sósavat, kénsavat vagy foszforsavat, előnyös szerves oldószerként toluolszulfonsavat vagy triklór-ecetsavat alkalmazunk. A reakciót előnyösen 90 °C és 130 °C közötti hőmérsékleten végezzük, annyi ideig, amíg a hidrolízis megfelelően végbemegy. Ez az idő általában 15-60 perc. A nyers, detoxikált endotoxin előállítását végezhetjük úgy is, hogy a kiindulási anyag reagáltatását a savval szerves oldószer, így például kloroform, metanol, etanol vagy ezek keverékének jelenlétében végezzük. A kapott nyers A lipidet acetonban oldjuk, amely különösen alkalmas a zsírsav-komponensek eltávolítására. Ezután az oldószer eltávolításával nyerjük a nyers detoxikált endotoxint. A fentiek szerint előállított nyers detoxikált endotoxint oldószerben oldjuk, majd alkalmas kromatografáló oszlopon - mint például molekulaszű5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65 2
