190420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoglikozid-antibiotikumok elkülönítésére erjesztéses oldatokból
1 190 420 2 oxálsav oldattal pH = 3-ra állítjuk, majd a savas oldatot 15 percig ezen a pH-értéken kevertetjük. Ezután az erjesztéses oldat pH-ját 25%-os ammónium-hidroxid oldattal pH = 7-re állítjuk be, majd a semlegesített oldathoz 100 ml ammónium-formájú Wofatit CP-300 ioncserélő gyantát adagolunk. A gyantát tartalmazó erjesztéses oldatot 4 órán át kevertetjük, majd 5 liter vízzel hígítjuk. Ezután a katiöncserélő gyantát az erjesztéses oldatból dekantálással és szűréssel eltávolítjuk, majd vízzel micélium-mentesre mossuk. Az ioncserélő gyantát kromatografáló oszlopba töltjük, majd 1 n ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk, 200 ml/óra sebességgel. Az eluálás során 20 ml-es frakciókat szedünk, amelyekben a sziszomicint vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal mutatjuk ki, adszorbensként szilikagélt, kifejlesztő elegyként kloroform : metanol : 25%-os ammónium-hidroxid (1 : 1 : 0,4) elegyet, előhívó reagensként 0,5%-os acetonos ninhidrin-oldatot alkalmazva. A sziszomicint tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd az oldat pH-ját hűtés közben 10 n kénsav-oldattal pH = 7-re állítjuk be. A semlegesített oldathoz 130 mg aktívszenet adunk, és az oldatot 15 percen át keverjük, majd leszűrjük. A szűrletet 75 ml ammónium-formájú Amberlite CG-50-I gyantát tartalmazó oszlopon (oszlopátmérő 2,1 cm, gyantarétegmagasság 27 cm) folyatjuk át, majd a gyantaágyat 700 ml ionmentes vízzel mossuk. Ezután 150 ml/óra sebességgel, 2 liter 0,1 n ammónium-hidroxid oldattal a kísérő szennyezéseket, majd 1 liter 0,2 n ammónium-hidroxid oldattal a sziszomicint oldjuk le az oszlopról. Az eluálás során 50 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket vékonyrétegkromatográfiás módszerrel vizsgálunk, a fenti abszorbenst és futtatórendszert alkalmazva. A csak sziszomicint tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban kb. 20 ml térfogatra bepároljuk. Ezt követően a sűrítmény pH-ját 5 n kénsavoldattal pH = 4,3-ra állítjuk, és a savas oldatot 250 mg aktívszén jelenlétében 30 percen át kevertetjük, majd leszűrjük. A szűrőt ionmentes vízzel mossuk, majd az egyesített szűrletet 10-szeres mennyiségű metanolhoz öntjük keverés közben. A kevertetést 30 percen át folytatjuk, majd a csapadékos oldatot 5 °C-on állni hagyjuk. Ezután a csapadékot kiszűrjük, majd metanollal mossuk, végül vákuumban 40-50 °C-on foszfor-pentoxid felett súlyállandóságig szárítjuk. így 3,27 g sziszomicinszulfátot kapunk. Az elkülönítési műveletsorozat hozama: 82%. [<x]q = — 104° (o= 1, víz). A termék fizikai jellemzői megfelelnek a Federal Register-ben [46, (8) 2987 (1981)] megadott követelményeknek. 2. példa Micromonospora purpurea var. nigrescens X-148 (MNG 122) törzzsel előállított 5 liter térfogatú, 850 pg/ml biológiai aktivitású erjesztéses oldat pH- ját keverés közben pH = 3-ra állítjuk telített oxálsav-oldattal, majd a savas oldatot 15 percig ezen a pH-értéken kevertetjük. Ezt követően az erjesztéses oldat pH-ját 25%-os ammónium-hidroxid oldattal pH = 7-re állítjuk, majd az erjesztéses oldathoz 150 ml ammónium-formájú Wofatit CP-300 ioncserélő gyantát adunk. A gyantát tartalmazó erjesztéses oldatot 4 órán át kevertetjük, majd 3 liter vízzel hígítjuk. Ezután a kationcserélő gyantát a hígított erjesztéses oldatból dekantálással és szűréssel eltávolítjuk, majd vízzel micélium-mentesre mossuk. Az ioncserélő gyantát oszlopba töltjük, majd 1 n ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk 200 ml/óra sebességgel. Az eluálás során 20 ml-es frakciókat szedünk, amelyekben a gentamicin C-komplexet vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal mutatjuk ki, adszorbensként szilikagélt, futtatórendszerként kloroform : metanol : 25%-os ammónium-hidroxid (1:1:1) oldószerkeverék alsó fázisát, előhívó reagensként 0,5%-os acetonos ninhidrin-oldatot alkalmazva. A gentamicinkomplexet tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd az oldat pH-ját hűtés közben 10 n kénsav-oldattal pH = 7-re állítjuk. A semlegesített oldathoz 210 mg aktívszenet adunk, és az oldatot 15 percig kevertetjük, majd leszűrjük. A szürletet 110 ml ammónium-formájú Amberlite CG-50-I gyantát tartalmazó oszlopon (oszlopátmérő 2,5 cm, gyantarétegmagasság 29 cm) folyatjuk át, majd a gyantaágyat 1 liter ionmentes vízzel mossuk. Ezután a gyantaoszlop eluálását sorrendben 300-300 ml 0,1 n, 0,125 n, 0,15 n, 0,175 n, 0,2 n és 1000 ml 0,25 n ammóniumhidroxid oldatokkal végezzük, 150 ml/óra sebességgel. Az eluálás során 30 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket vékonyrétegkromatográfiás módszerrel vizsgálunk, a fenti abszorbenst és futtatórendszert alkalmazva. A gentamicin C-komplexet tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban kb. 20-25 ml térfogatra bepároljuk. Ezután a kapott oldat pH-ját 5 n kénsav-oldattal pH = 4,5-re állítjuk be, és a savas oldatot 320 mg aktívszén jelenlétében 30 percen át kevertetjük, majd leszűrjük. A szűrőt ionmentes vízzel mossuk, majd az egyesített szűrletet keverés közben 10-szeres mennyiségű metanolhoz öntjük. A kivált gentamicin-C-szulfátot 5 °C-on történő állás után kiszűrjük, metanollal mossuk, majd 40-50 °C-on vákuumban súlyállandóságig szárítjuk. így 3,1 g gentamicin-C-szulfátot kapunk, amelynek fizikai jellemzői megfelelnek a The United States Pharmacopeia-ban [XX, 348 (1980)] megadott követelményeknek. 3. példa Streptomyces tenebrarius (MNG 204) törzzsel előállított 5 liter térfogatú, 1200 pg/ml biológiai aktivitású erjesztéses oldathoz keverés közben 97,7 ml 40%-os nátrium-hidroxid oldatot adunk, majd a lúgos oldatot 30 percen át 95-100 °C-on tartjuk. Szobahőmérsékletre történő visszahűtés után az oldat pH-ját telített oxálsav-oldattal pH = 3-ra állítjuk be, majd a savas oldatot 15 percig ezen a pH-értéken kevertetjük. Ezután az erjesztéses oldat pH-ját 25%-os ammónium-hidroxid oldattal pH = 7-re állítjuk be, majd a semlegesített 5 10 15 20 25 30 36 40 45 50 55 60 65 4
