190420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoglikozid-antibiotikumok elkülönítésére erjesztéses oldatokból
1 190 420 2 esetben az antibiotikum vagy antibiotikum-komplex gyógyászatban felhasználható sóját előállítjuk. Az erjesztéses oldatban lévő kétértékű kationok leválasztására előnyösen oxálsavat alkalmazunk. Az erjesztéses oldatból az antibiotikumot vagy antibiotikum-komplexet az erjesztéses oldat biológiai aktivitásától függő mennyiségű, előnyösen az antibiotikum grammjára számítva 30-40 ml ammónium-formájú, karboxil-típusú ioncserélő gyantával kötjük meg. A megkötést előidézhetjük az ioncserélő gyanta erjesztéses oldatba való bekeverése, illetve az adott esetben meghígított erjesztéses oldat ioncserélő gyantával töltött lebegőágyas oszlopon történő átáramoltatása útján. Az abszorpciós ioncserélős technikát célszerűen semleges pH-jú közegben alkalmazzuk. Az ioncserélési műveletben előnyösen alkalmazhatók a Wofatit CP-300 (VEB Farbenfabrik Wolfen, DDR), Varion KCO (Nitrokémia Ipartelepek, Fűzfőgyártelep), Amberlite IRC-50 (Fluka AG, Buchs, Svájc) kationcserélö gyanták. A bekeveréses technikát alkalmazva vizsgálataink szerint a fenti kationcserélő gyanta mennyiséggel a megkötési művelet 3-4 óra alatt teljessé válik, ha az erjesztéses oldatot megfelelően kevertetjük. A megkötési művelet befejezése után az erjesztéses oldatot előnyösen vízzel hígítjuk. Az antibiotikumot vagy antibiotikum-komplexet tartalmazó kationcserélö gyantát a mikroorganizmus sejtjeitől dekantálással vagy beépített fémszitaszövetet [előnyös fonalköz: 0,353 mm (British standard: 44 mesh)] tartalmazó szűrőberendezésen szűréssel vagy a két művelet kombinálásával választhatjuk el. Amennyiben a lebegőágyas ioncserélő technikát kívánjuk alkalmazni a találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a fermentlét a kétértékű kationok csapadék formájában való leválasztása után viszkozitásától függő mértékben ionmentes vízzel hígítjuk és ammónium-ciklusú kationcserélő gyantával töltött lebegőágyas oszlopon áramoltatjuk át. A lebegőágyas oszlopot előnyösen olyan beépített fémszitaszövettel (előnyös fonalköz a fenti) látjuk el, amely a mikroorganizmus sejtjeit átengedi, míg az ioncserélő gyantaszemcséket a lebegőágyban tartja. Tapasztalataink szerint előnyös az antibiotikumot vagy antibiotikum-komplexet 1 n ammóniumhidroxid oldattal leoldani a kationcserélő gyantáról. A kívánt antibiotikumot vagy antibiotikumkomplexet a kísérő minor antibiotikum-komponensektől és a bioszintézis melléktermékeitől célszerűen finomszemcsés karboxil-típusú, kationcserélő, előnyösen Amberlite CG-50-I (Fluka AG, Buchs, Svájc) gyantaoszlopon kivitelezett kromatográfiával választjuk el, egyre növekvő koncentrációjú ammónium-hidroxid oldatokat alkalmazva. Az előállított antibiotikum vagy antibiotikumkomplex bázist kívánt esetben farmakológiailag elfogadható sóvá alakítjuk valamely alkalmas szervetlen savval, előnyösen kénsavval. Az erjesztéses oldatok biológiai aktivitását agar-diffúziós módszerrel (J. S. Simpson : Microbiological Assay Using Large Plate Methods, Analytical Microbiology; Acad, Press. New York, 1963, 87 124. old.) mérjük, előnyösen Staphylococcus epidermidis tesztorganizmust használva. . A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint úgy járunk el, hogy pl. a sziszomicinl vagy gentamicint tartalmazó erjesztéses oldathoz oxálsav-oldatot adunk a kétértékű kationok leválasztása céljából, majd ezt követően ammóniumhidroxid oldattal semlegesítjük (pH = 7) az erjesztéses oldatot, és ammónium-formájú, karboxil-típusú ioncserélő gyantával (Wofatit CP-300) kölcsönhatásba hozva a sziszomicint vagy gentamicint megkötjük. Ezután az antibiotikumot a kalioncserélő gyantáról 1 n ammónium-hidroxid oldattal leoldjuk, majd az eluátum-frakciókat 10 n kénsavoldattal semlegesítjük. A sziszomicin vagy gentamicin nyersterméket tartalmazó oldatot ezután finomszemcsés karboxil-típusú, ammónium-formában levő ioncserélő gyantaoszlopon (Amberlite CG-50-I) kromatografáljuk, 0,1-0,25 n koncentrációm ammónium-hidroxid oldatokat alkalmazva. Az antibiotikumot tartalmazó frakciók betöményítése után a tiszta bázis ismert módon gyógyászaidig felhasználható sóvá (például szulfáttá) alakítható át. Amennyiben a találmány értelmében tobramicint kívánunk elkülöníteni 6"-0-karbamoil-tobramicint tartalmazó erjesztéses oldatból, úgy előnyösen először a 176 103 sz. közzétett magyar szabadalmi leírás szerint eljárva az erjesztéses oldatban nátrium-hidroxiddal melegítés közben elvégezzük a 6"-0-karbamoil-tobramicin hidrolízisét tobramicinné majd a továbbiakban mindenben a fentiek szerint eljárva célszerűen szulfát sója alakjában elkülönítjük a tobramicint. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a nagytisztaságú aminoglikozid-antibiotikumok előállításához szükséges műveletek igen egyszerűek, anyagigényük minimális, és az eljárás hozama (75—85 %) igen jó. Az eljárást alkalmazva nincs szükség a mikroorganizmus sejtjeinek az erjesztéses oldatból való eltávolítására, az antibiotikum vagy antibiotikum-komplex megkötése közvetlenül az erjesztéses oldatból történhet. így egyrészt kisebb a hozam csökkenését előidéző szűrési műveletek száma, másrészt lerövidül a megkötés időtartama, ami munkaidőmegtakarítással jár. Az eljárás műveletei a közbeeső termékek izolálása nélkül folyamatosan vihetők végbe, és az eljárás, szemben a korábbi eljárásokkal, csak egy bepárlási műveletet tartalmaz, ami jelentős energiamegtakarítást eredményez. Az eljárás ipari méretben egyszerűen, nagyobb beruházás nélkül megvalósítható, mert nem igényel költséges feldolgozó berendezéseket (pl. dobszürőt a mikroorganizmus sejtjeinek elkülönítésére). A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa Micromonospora rosea (MNG 182) törzzsel előállítót' 5 liter térfogatú, 515 pg/ml biológiai aktivitású erjesztéses oldat pH-ját keverés közben telített 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
