190420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoglikozid-antibiotikumok elkülönítésére erjesztéses oldatokból
1 . 190 420 2 A találmány tárgya eljárás nagytisztaságú aminoglikozid-antibiotikumok elkülönítésére erjesztéses oldatokból. Ismeretes, hogy különböző sugárgombák és baktériumok Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok ellen hatásos aminoglikozid-antibiotikumokat bioszintetizálnak, melyek eredményesen alkalmazhatók a gyógyászatban urogenitális, légúti és emésztőrendszeri fertőzések, valamint sebészeti fertőzések kezelésére. így pl. a Micromonospora inyoensis NRRL 3292 (3 832 286 sz. és 3 907 771 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások), a Micromonospora rosea MNG 182 (179 146 sz. magyar szabadalmi leírás) sziszomicint, a Streptomyces tenebrarius ATCC 17 920 (1 178 489 sz. angol szabadalmi leírás), a Streptomyces tenebrarius MNG 169 (176 103 sz. magyar szabadalmi leírás) apramicint, 6"-0-karbamoil-kanendomicint és 6"-0-karbamoil-tobramicint; a Streptomyces tenebrarius MNG 204 6"-0-karbamoil-tobramicint; a Micromonospora purpurea NRRL 2953, a Micromonospora echinospora NRRL 2985 (3 091 572 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), a Micromonospora purpurea var. nigrescens X-148 MNG 122 (168 778 sz. magyar szabadalmi leírás) gentamicin C-komplexet termel. A fenti aminoglikozid-antibiotikumok az.erjesztéses tápoldatban többé-kevésbé kötődnek a mikroorganizmusok sejtjeihez. Ez a kölcsönhatás csökkenthető savas vagy lúgos körülmények kialakításával, különféle sók alkalmazásával, hőkezeléssel és ultrahang besugárzással. Az aminoglikozid-antibiotikumoknak fermentációs oldatokból történő kinyerésekor általában úgy járnak el, hogy a fermentáció befejezése után a fermentlét először megsavanyítják (pH = 2), majd a mikroorganizmusok sejtjeit szűréssel eltávolítják. A szűrletből semlegesítés után az antibiotikumot karboxil-típusú kationcserélő gyantával nyerik ki. Az ioncserélő gyantán megkötött antibiotikumot savas (kénsav) vagy bázikus (ammónium-hidroxid) oldattal oldják le a gyantáról, majd az eluátumot bepárolják vagy az antibiotikum szervetlen savval képzett sóját csapadék formájában leválasztják, s így jutnak a nyerstermékhez (pl. 1 178 489 sz. angol, 174 315 és 168 788 sz. magyar, 3 907 771 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, 179 147 sz. magyar szabadalmi leírás). Ismeretes az aminoglikozid-antibiotikumok erjesztéses oldatokból való elkülönítésére olyan módszer is, amely szerint a mikroorganizmus sejtjeitől mentesített szűrletből oldhatatlan komplex-só alakjában leválasztják az antibiotikumot (pl. nátrium-dodecil-szulfoacetáttal), majd az így kapott komplex-só megbontása után jutnak el a kívánt végtermékhez (3 691 279 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ezek az általánosan alkalmazott elkülönítési módszerek azonban nem biztosítják az erjesztéses oldatban levő antibiotikumok teljes kinyerését. A mikroorganizmus sejtjei és az antibiotikumok közötti kölcsönhatás csupán részleges megszüntetése, a többszöri szűrési műveletek, az eluátumok savas vagy lúgos körülmények közötti betöményítése csökkentik a kinyerési művelet végső hozamát. így ez utóbbi az alkalmazott elkülönítési, illetve tisztítási műveletektől függően tág határok között változhat (pl. a sziszomicin-bázist a 3 907 771 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 3. példája szerint 13%-os, a 179 147 sz. magyar szabadalmi leírás 1. példája szerint 56%-os, a gentamicin C-komplexet a 3 091 572 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 3. példája szerint mintegy 38%-os, a 168 778 sz. magyar szabadalmi leírás 9. lépése szerint 63%-os hozammal állítják elő). A találmány célja olyan általánosan alkalmazható, egyszerű és gazdaságos eljárás kidolgozása, amely a megfelelő mikroorganizmusok erjesztéses oldatából gyorsan, minimális veszteséggel, magas hozammal teszi lehetővé az aminoglikozid-antibiotikumok elkülönítését gyógyászati felhasználásra alkalmas tisztaságban. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy ha az aminoglikozid-antibiotikum kationcserélő gyantán való megkötését közvetlenül a kétértékű kationok lecsapása során kapott és semlegesített csapadékos erjesztéses oldatban végezzük, úgy lehetővé válik az erjesztéses oldat antibiotikum tartalmának teljes kinyerése. Megfigyeltük, hogy ilyen körülmények között az ioncserélő gyanta hatására egyaránt végbemegy a mikroorganizmus sejtjeihez kötött aminoglikozidantibiotikum deszorpciója és az erjesztéses oldatban lévő - illetve a deszorpció révén abba kerülő - antibiotikum ioncserélő gyantán való megkötése. Továbbá azt találtuk, hogy ha az antibiotikum megkötése után az erjesztéses oldatot kellő mértékűre hígítjuk, az ioncserélő gyanta - a mikroorganizmus sejtjei és az ioncserélő gyanta közötti fajsúly és méretkülönbség alapján - dekantálással vagy az ioncserélő gyanta szemcseméreténél kisebb pórusú szűrőberendezést alkalmazva, veszteségmentesen elkülöníthető a mikroorganizmus sejtjeit tartalmazó tápoldatból. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás nagytisztaságú aminoglikozid-antibiotikumok vagy antibiotikum-komplexek és farmakológiailag elfogadható sóik elkülönítésére erjesztéses oldatokból az adott esetben jelenlévő kétértékű kationok vízben oldhatatlan só formájában való leválasztásával, az antibiotikumoknak vagy antibiotikumkomplexeknek kationcserélő gyantán történő megkötésével és azt követő elúcióval, majd az így kapott nyerstermék-eluátum kromatográfiás tisztításával, és kívánt esetben ezt követő sóképzéssel, amely abban áll, hogy az erjesztéses oldatban lévő kétértékű kationok leválasztása után a kapott csapadékot és a mikroorganizmus sejtjeit tartalmazó erjesztéses oldatot közvetlenül ammónium-formájú karboxil-típusú ioncserélő gyantával kölcsönhatásba hozva az antibiotikumot vagy antibiotikumkomplexet pH = 4-8 értéken, előnyösen pH = 7 megkötjük, majd az antibiotikumot vagy antibiotikum-komplexet tartalmazó ioncserélő gyantát és a mikroorganizmus sejtjeit egymástól alkalmas módon elkülönítjük, ezután az antibiotikumot vagy antibiotikum-komplexet ismert módon az ioncserélő gyantáról leoldjuk és megtisztítjuk, és kívánt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
