190358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enduracidi előállítására
1 190 358 2 bouillon tápközeget inokulálunk 1 ml spóraszuszpenzióval, majd 28 °C-on négy órán át rázatjuk Ezzel a kezeléssel a spórák mintegy 73%-a elpusztul. Az így kezelt szuszpenziót 3000 fordulat/perc sebességű centrifugál-szeparálásnak vetjük alá. Az így kicsapott spórákat elkülönítjük és 1 ml steril vízben szuszpendáljuk. Ebből a spóraszuszpenzióból 0,1 ml-t 9 cm átmérőjű lemezre szélesztünk, amely lemez 60 mikrogramm/ml m-fluoro-DL- tirozinnal kiegészített minimál agar tápközeget tartalmaz, a lemezt 28 °C-on hat napon át inkubáljuk. Hat nappal később a telepek száma eléri a 180 db/Iemezt. Közülük található néhány nagyméretű telep (kb. 1,5-2,0 mm átmérőjű), mintegy 10 db lemezenként, ezeket 60 mikrogramm/ml koncentrációban m-fluoro-DL-tirozint tartalmazó minimal agar táptalajra szélesztjük. A szélesztett táptalajt 28 °C-on hat napon át inkubáljuk. Ez után az ezen a táptalajon növekvő törzseket ferde agarra visszük át spórázás céljából. Ezek a törzsek Streptomyces fungicidicus GAB-453 törzsből indukált m-fluoro- DL-tirozin rezisztens törzsek. Az így nyert 75 törzset 28 ”C-on nyolc napon át az 1. Táblázat szerinti B jelű tápközegben inkubáljuk, majd a termelőképességet meghatározzuk. Ezek közül 68 törzs mutat nagyobb termelőképességet, mint a Streptomyces fungicidicus GAB-453 szülőtörzs. A 68 törzs közül egy törzs különösen erős termelőképességet mutat. A fenti módszerrel nyert törzset neveztük el Streptomyces fungicidicus Emt 2-140-nek. Ha ezt a törzset az 1. Példa (1) részben ismertetett eljárás szerinti mérésnek vetjük alá, 24 mm átmérőjű kerek Bacillus subtilis növekedés-gátlási zónákat kapunk, azaz nem következik be változás az enduracidinkiválasztási képességben. 2. Példa 20 ml inokulum tápközeget, amely 3,5% kukoricalekvárt, 2,5% kukoricalisztet, 0,5% kukoricasikér-lisztet, 3,0% kalciumkarbonátot és 0,05 Actocol habzásgátlót tartalmaz, és amelynek pH-ja 6,2, 200 ml-es Erlenmeyer lombikba pipettázunk, majd a lombikot 120 °C-on 15 percen át autóklávozzuk. Az így sterilezett inokulum tápközeget 1 ml olyan szuszpenzióval oltjuk be, amely mintegy 2 • 108 Streptomyces fungicidicus Emt 2-140 (IFO 14 088) törzsből származó spórát tartalmaz. (A Streptomyces fungicidicus törzset az 1. Példa (3) része szerint alakítottuk ki). Az így beoltott inokulumot 28 °C- on 24 órán át rázatás közben inkubáljuk. Az 1. Táblázat szerinti B tápközegből 30 ml-t pipettázunk egy másik 200 ml-es Erlenmeyer lombikba, a lombikot 120°C-on 30 percig autoklávozzuk. A korábban említett inokulum-tenyészetből 2,5 ml-t viszünk át ebbe a lombikba, majd inkubáljuk rázás közben 28 °C-on nyolc napon át. Az igy nyert fermentlé 4330 mikrogramm/ml enduracidint tartalmaz. A fenti fermentlé 2 literéhez 40 g Hyflo Super Cel szűrési segédanyagot adunk, a keveréket szívással szűrjük 30 cm átmérőjű Büchner-tölcséren, Toyo Roshi N°2. szűrőpapíron át. A szűréssel nyert micélium-részt 6 liter ionmentes vízzel mossuk, majd ismét szűrjük. 480 g így nyert nedves micélium-részt 1 liter ionmentes vízzel zaggyá keverünk ki, ehhez 2 liter metanolt adunk. A keverékhez ezután 5 n sósavat adunk, és amikor a pH 3 és 4 közé beállt, a keveréket szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük, majd szűrjük, így 2810 ml extraktumot nyerünk (enduracidin-tartalom: 2460 mikrogramm/ml). Ezt a savas extraktumot pH 6-ra állítjuk be 10 n NaOH-val, a keverékhez 30 g Hyflo Super Cel-t adunk/ és az így nyert amorf csapadékot szűréssel eltávolítjuk. 2700 ml így nyert semlegesített extraktum-oldatot aktív szén oszlopra viszszük fel (500 ml). Az oszlopot 500 ml 60%-os metanollal és egy liter ionmentes vízzel mossuk, majd az enduracidint 0,02 n sósavat tartalmazó 70%-os vizes acetonnal eluáljuk. 1,3 liter (4610 mikrogramm/ml enduracidin tartalmú) így nyert oldatot legfeljebb 45 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson 500 ml-re párolunk be. A sűrítményhez 200 ml metanolt adunk, és a keveréket újból bepároljuk csökkentett nyomáson 500 ml-re. Ezt a fenti folyamatot megismételjük, így az acetont desztillációval eltávolítjuk. Az így nyert 540 ml sűrítményhez 90 ml vizet, 1100 ml metanolt és 12,5 g nátriumkloridot adunk, majd a pH-t 10 n nátriumhidroxiddal 7-re állítjuk. Az így nyert amorf csapadékot szűréssel eltávolítjuk. 2530 ml, 2173 mikrogramm/ml koncentrációjú szűrlet marad vissza. Ezt a szűrletet keresztül visszük egy előzetesen mosott, 700 ml Amberlite XAD 2-t tartalmazó oszlopon. Az oszlop előzetes mosása 4 liter, sósavra 0,01 n 70%-os metanollal és 3 liter 50%-os metanollal történik, majd az enduracidint sósavra 0,006 n 50%-os metanollal eluáljuk. 650 ml (7530 mikrogramm enduracidin/ml) így nyert frakcióhoz 2 g aktív szenet adunk, majd a keveréket 30 percig kevertetjük, az aktív szenet kiszűrjük, ilyen módon 620 ml tiszta oldatot nyerünk. Ezt a tisztított oldatot egymás után két oszlopon engedjük át sómentesítés céljából: az egyik 90 ml Amberlite IR-120 gyantát (H- típus), a másik 90 ml IR-45 gyantát (OH-típus) tartalmaz. Az oszlopokat 90-90 ml 50%-os metanollal mossuk, a mosó folyadékokat a sómentesített oldatokkal egyesítjük, így 650 ml oldatot nyerünk. Az oldat egy kis részét 0,1 n sósavval hígítjuk ezt az oldatot az abszorpció meghatározására használjuk fel. A 272 nm-nél mért adszorpció alapján az enduracidin-tartalom 3,92 g-nak kalkulálható. 4z egész oldatot 2 n sósavval pH 4,0-ra állítjuk be, majd csökkentett nyomáson 120 ml térfogatra sűrítjük be. A sűrítményt jégfürdőben lehűtjük, és 10 n nátriumhidroxiddal pH 9-re állítjuk be. Az így nyert szabad enduracidin bázist centrifugálással különítjük el, és 20 ml hideg, 70%-os vizes metanollal mossuk. A mosott szabad enduracidin bázist 40 ml metanolban szuszpendáljuk és ekvimoláris mennyiségű 1 n sósav (1,6 ml) hozzáadásával feloldjuk. Ezután a pH értékét 7-re állítjuk be. Ezt az oldatot csökkentett nyomáson mintegy 15 ml-re sűrítjük, amikor is fehér kristályok válnak ki. A sűrítményt 5 °C-on 2 napon át állni hagyjuk, majd a kristályokat 4. sz. üvegszűrőn kiszűrjük. Az így nyert nedves kristályokat 3 ml víz és 26 ml metanol keverékben szuszpendáljuk. A szuszpenziót 50-55 °C-ra melegítjük és ilyen módon a kristályokat feloldjuk. Eh-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
