190358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enduracidi előállítására
1 190 358 2 he/ az oldathoz adunk 30 mg porított aktív szenet, és a keveréket 40 °C-on 20 percen át kevertetjük, majd az aktív szenet szűréssel eltávolítjuk (Millipore FH típusú szűrő). A szűrletet csökkentett nyomáson mintegy 15ml-re sűrítjük, amikoris kristá- 5 lyok válnak ki. A kristályokat 15 órán át 50 °C-on szárítjuk, ilyen módon végül 2,62 g fehér, hasábszerű enduracidin-monohidrokloridot nyerünk, o.p. 240-248 °C (bomlik). Elemanalízis%: Mért: C: 52,56±0,5; H: 6,20±0,3; N: 14,70±0,5; Cl: 10 4,20±0,6. Forgatóképesség: [a]o + 87°±10 (c = 0,5; dimetilformamid). UV abszorpció: C:HClnm/E'^m = 231 (220± 10), 272 (123± 10). Enduracidin tartalom: Enduracidin A: endura- 15 cidin B = 62 : 38, ezen kívül kb. 1 % enduracidin C-t és nyomnyi enduracidin D-t is tartalmaz. [Az analízis nagynyomású folyadék-kromatográfiával (HPLC) történt]. 3. Példa 500 ml, 2. Példa szerinti összetételű inokulum tápközeget 2 liter térfogatú Sakaguchi-lombikba 2s helyezünk, majd 120°C-on 30 percig autoklávozzuk. Az így sterilezett tápközeget 2 ml spóraszuszpenzióval (amely mintegy 109 spórát jelent) inokuláljuk ; a spórák az 1. Példa (3) része szerinti eljárással indukált Streptomyces fungicidicus Emt 2-140 2o törzs spórái. A tápközeget rázás közben inkubáljuk 28 °C-on 24 órán át. Az így nyert inokulumból 500 ml-t 501 térfogatú fermentorba viszünk át, amely 30 1, fenti összetételű inokulum tápközeget tartalmaz, majd a fermentorban inkubálunk 28 :c 35 hőmérsékletén 28 oran at 30 1/perc levegosebesseggel levegőztetve és 280 fordulat/perc sebességgel kevertetve. Az így inkubált inokulumból 8 litert viszünk át egy 200 liter térfogatú fermentorba, amely 100 liter, az 1. Táblázat szerinti B tápközeget 40 tartalmaz. A fermentorban 28 °C-on 8 napon át inkubálunk, 180 1/perc levegősebességgel levegőztetve és 180 fordulat/perc sebességgel kevertetve. Az így nyert fermentlé (88 liter) 4530 mikrogramm/ml enduracidint tartalmaz. 4. Példa 20 ml, 200 ml térfogatú Erlenmeyer lombikban levő, 2. Példa szerinti összetételű inokulum tápközeget 1 ml spóraszuszpenzióval (amely mintegy 1.5108 spórának felel meg) inokulálunk, a spórák az. 1. Példa (1) része szerinti eljárással indukált Streptomyces fungicidicus GAB 453 törzs spórái. A tápközeget rázatás közben 28 °C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk. 30 ml, 1. Tálázat szerinti tápközeget pipettázunk egy másik, 200 ml térfogatú Erlenmeyer lombikba, majd 120 °C-on 30 percen át sterilezzűk. Az így sterilezett tápközegbe 2,5 ml fenti inokulumot viszünk be, majd rázatás közben 28 °C-on 8 napon át inkubáljuk. Az így nyert fermentlé 1870 mikrogramm/ml enduracidint tartalmaz. 5. Példa 20 ml, 200 ml térfogatú Erlenmeyer lombikban levő, 2. Példa szerinti összetételű inokulum tápközeget 1 ml spóraszuszpenzióval (amely mintegy 3 • 10® spórának felel meg) inokulálunk, a spórák az 1. Példa (2) része szerinti eljárással indukált Streptomyces fungicidicus Emt 36-3 törzs (IFO 14 037) spórái. A tápközeget rázatás közben 28 °C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk. 30 ml, 1. Táblázat szerinti B tápközeget (azzal a módosítással, hogy 6,0%-ra módosítjuk a kukoricaliszt koncentrációját) pipettázunk egy másik, 200 ml térfogatú Erlenmeyer lombikba, majd 120°C-on 30 percig sterilezzűk. Az igy sterilezett tápközegbe 2,5 ml fenti inokulumot viszünk be, majd rázás közben 28 °C-on 8 napon át inkubáljuk. Az így nyert fermentlé 3100 mikrogramm/ml enduracidint tartalmaz. 6. Példa 2 liter, 3. Példa szerint nyert fermentlevet pH 5,5-re állítjuk be, majd 70 °C-on melegítjük 30 percen át. 40 g Hyflo Super Cel szűrési segédanyagot adunk a fermentléhez, és a keveréket szívatással leszűrjük 30 cm átmérőjű Büchner-tölcséren, Toyo Roshi N°2 típusú szűrőpapíron. Az így nyert micélium-részt 6 liter ionmentesített vízzel átmossuk. A nedves micéliumot (570 g) csökkentett nyomáson, 55 °C-on 6 órán át szárítjuk, majd deszikkátorban, szobahőmérsékleten foszforpentoxid fölött tovább szárítjuk 3 napon át. Az így nyert szárított anyagot mozsárban megőröljük, és 106 g, halványbarna, száraz, micéliumot tartalmazó port nyerünk, amelynek enduracidin tartalma 73,4 mg/g. Szabadalmi igénypont Eljárás (I) általános képletű enduracidin előállítására - a képletben R jelentése (CH3)2=CH— (CH2)4—CH=CH—CH=CH— vagy C2H5— CH(CH3)—(CH2)4—CH=CH—CH=CH— képletű csoport, vagy 11-14 szénatomos zsírsavmaradék -, azzal jellemezve, hogy Streptomyces fungicidicus fajba tartozó - előnyösen S. fungicidicus GAß 435 (IFO 14 036), Emt 36-3 (IFO 14 037) vagy Emt 2-140 (IFO 14 088) - mikroorganizmust tenyésztünk, és a képződött enduracidint kinyerjük. 1 oldal rajz 6
