190214. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növények regenerálásának elősegítésére szövettenyészetből
1 190 114 2 A találmány tárgya eljárás növények regenerálásának elősegítésére szövettenyészetből. A növényi szövettenyésztés, illetve sejtgenetika az elmúlt évtizedben számos ígéretes eredményt ért el, új, hatékony módszereket dolgozva ki a mutánsizolálás, szomatikus hibridizáció, citoplazmatranszí'er stb, területén. Ezek gyakorlati felhasználásának egyik komoly akadálya, hogy a gazdaságilag fontos egysziküekben még csak a legalapvetőbb szövettenyésztési módszereket lehet alkalmazni. Az egyszikű növényekkel kapcsolatos főbb szöveltenyésztési problémák a következők: a) a szövettenyészetet csak funkcionálisan is osztódó növényi részekből (embrió, éretlen virágzat, fiatal levélrész) lehet indítani; b) a differenciálatlan szövetrészekben (kalászokban) nincs klorotillképződés, tehát a kalluszok fehérek ; c) a szövettenyészetből történő növényregeneráció, akár organogenezisen (szervképzésen), akár embriogenezisen (embrióképzésen) keresztül, esetleges, ez. a képesség az átoltások során gyorsan elveszik, és csak bizonyos genotípusokban van meg [Vasil, 1. K., Plant improvement and somatic cell genetics (kiadó: I. K. Vasil és munkatársai) Academic Press: New York, 179-203 (1982)]. K problémák megoldására, a kétsziküeknél bevált stratégiát követve, számos hormont, illetve hormonkombinációt próbáltak ki, de lényeges eredményt nem értek el [Dudits, D. és mtsai: Can. .1. Bot. 53, 957-963 (1975)]. A leghasználhatóbb eljárás szerint éretlen embrióból 1 mg/1 koncentrációjú 2,4-D (2,4-diklór-fenoxi-ecetsav; egy auxintípusú hormon) jelenlétében kalluszt lehet indukálni, majd a hormon fokozatos megvonásával, organogenezisen, illetve embriogenezisen keresztül ebből újra növényt lehet regeneráltatni [Sears, R. G. és mtsai: Crop. Sei. 22, 546-550 (1982)]. Az eljárás hátránya, hogy a kalluszokat fokozatosan csökkenő 2,4-D-tartalmú táptalajokra kell átoltani, így az eljárás körülményes és hosszadalmas. Kölesfélékben lehetséges volt protoplaszteredetű kalászokból embriogenezisen keresztül növényeket regeneráltatni [Vasil, I. K. : Plant improvement and somatic cell genetics (kiadó: 1. IK. Vasil és mtsai), Acad. Press: New York, 179-203 (1982); Vasil, I. K.: Genetic engineering in enkaryotes (kiadó: P. F. Lurguin, A. Kleinhofs) Plenum Press: New York, 233-252 (1983)], azonban az embrioidok 90-99%-a nem jutott túl a hajtáskezdeményes állapoton. A kétsziküeknél általában megfelelő hormonkombinációkkal kielégítő regeneráció érhető el, de idősebb tenyészeteknél, illetve magasabb kromoszómaszámú hibrideknél a regenerációs képesség erősen lecsökken. A problémák fő forrása, hogy az auxinok, amelyek egy bizonyos koncentrációban hatékonyan segítik a sejtosztódást, magas koncentrációban gátolják azt, emellett regeneráció- és zöldülésgátló hatásuk is ismert. így feltehető, hogy az egyszikűek megállapodott sejtjeinek osztódásképtelensége, illetve az egy- és kétszikűek bizonyos szövettenyészetének gyenge regenerációs és zöldülési képessége a magas belső auxin- vagy más hormonszint következménye. Felmerült a gondolat, hogy ezeket a nehézségeket bizonyos hormongátlók adagolásával meg lehetne oldani. Az ilyen próbálkozások azonban nem vezettek eredményre, mert a kísérletek azt mutatták, hogy az antiauxinoknak (például TIBA) csupán erős növekedésgátló hatásuk van a szövettenyészetben. Kísérleti tapasztalat ugyanakkor, hogy magas auxintartalmú táptalajon előállított, nem regeneráló kalluszokban igen magas az etilénszint [Huxter T. J. és mtsai: Physiol. Plant. 53, 319-326 (1981); Grady, K. L. és mtsai: Plant. Physiol. 70, 919-921 (1982); Garcia, F. G. és mtsai: Ann. Bot. 51, 207-295 (1983)]. Találmányunk kidolgozásánál azt a célt tűztük ki magunk elé, hogy az eddig ismerteknél lényegesen hatékonyabb módon elősegítsük a növények regenerálását szövettenyészetekből. Találmányunk alapját az a meglepő felismerés képezi, hogy a regeneráció lényegesen megjavítható, ha a növények fenntartásához használt hormontartalmú, vagy azzal azonos összetételű, de hormonmentes táptalajhoz etilénképződést gátló vagy etiléngátló adalékot adunk. Ennek megfelelően, a találmány tárgya eljárás szövettenyészetekben fenntartott növényi sejtekből differenciált növény regenerálásának elősegítésére, oly módon, hogy a fenntartáshoz használt hormontartalmú vagy hormonmentes, önmagában ismert táptalajhoz etilénképződést gátló vagy etiléngátló adalékot adunk. Az etilénképződést gátló adalékok olyan anyagok, amelyek az etilén szintézisét gátolják, míg az etiléngátlók kompetitiv úton fejtik ki hatásukat. Az irodalomban számos etiléngátló, illetve etilénképződést gátló anyagot ismertettek [lásd például: What's new in plant physiology, 12, 37-40 (1981)]. Ilyen anyag például az AgN03, CoCl2, C02, különböző szerves vegyületek, például dinitro-fenol, 2,5-norbornadién stb. Azt találtuk, hogy ezek az anyagok egyformán felhasználhatók a találmány szerinti megoldás kivitelezéséhez. A találmány szerinti eljárás az egy- és kétszikű növények széles körére, így például különböző gabonafélék, dohány és egyéb kultúrnövények regenerálására is kiválóan alkalmazható. így, találmányunk gyakorlati megvalósítása során egyszikű és kétszikű növények szövettenyészetéből egyaránt kiindulhatunk. A találmány szerinti eljárásban felhasznált adalékanyagok közül különösen előnyös az ezüstnitrát és a kobalt-klorid alkalmazása. A koncentráció tág határok között változtatható, és erősen függ az adott etiléngátló anyagi minőségétől, a regenerálni kivánt növénytől, annak előkezelésétől stb. Az optimális koncentráció meghatározása, az összes körülmény figyelembevételével, a szakember feladata. Az etilénképződést gátló vagy etiléngátló adalékokat hozzáadhatjuk magához a növényi sejtek fenntartására használt, hormontartalmú táptalajhoz, de eljárhatunk úgy is, hogy a kallusztenyészetet előzetesen hormonmentes táptalajra helyezzük át. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint az adalékot hormonmentes táptalajhoz adjuk. A táptalaj tetszőleges, a növényi r 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
