190134. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mutagén anyagok jelenlétének és mennyiségének a meghatározására
6 190134 niemi, O. és Jarnefelt, J., „Discrete Multichannel Analyzing Systems with a Vertical Optical Path and Batch Processing", 1982., Internationa/ Laboratory (nyomtatás alatt) |. A vizsgálat és a sejtek növekedése egy 37 *C-ra állított inkubátor-dobosban játszódik le, egy 9x1 ml-es kOvetta-késsletben, mintánként egy kOvelta használatéval, vagy Davis-Mingloli [Mutation Research, 38. (1976.) 34. oldal], Vogel-Bonner [Mutation Research, 113. (1983.) 205. oldal] vagy bármely más, megfelelő szub-mlnimál folyadék tápközegben. A sejttenyészet eredeti mennyisége 5 xlO* sejt, és a saját kontrolljaként használjuk FP 901-ben, ami után a sejtek növekedése által az elnyelésben okozott változás dAarn/lO* sejt = 0,001, A mutagenizáció állapotában a sejtek a növekedési faktor hatására auxotrófként ötször osztódnak. Miután az összes növekedési faktort felhasználták, az auxotróf sejtek növekedése leáll, de a prololróffá mutált sejtek folytatják növekedésüket. Minél nagyobb a prototróf sejtek aránya a teljes populációban, annál gyorsabban érnek el mérhető sűrűséget. A detektálásig eltelt időt nem-toxikus minták esetében közvetlenül használhatjuk a mulagón aktivitás mértékeként. A vizsgálat végrehajtásához szükséges idő a teszt-organizmus növekedési ütemétől függően változik: E. coli és S. typhimurium esetében ez nem haladja meg a 24 órát. Az elnyelési értékekből kapott görbe tipikus jellemzője a diauxiás növekedésnek, ami akkor figyelhet meg, ha egy baktérium-kultúrát kétféle szénforrás jelenlétében tenyésztünk (Stanier és munkatársai: General Microbiology, 308. oldal, 1970.). Az 1. ábrán az 1. görbe a nem-gátolt növekedésnek felel meg (nem toxikus, a túlélési arány 100%), a 2. görbe 80%-os túlélési arányt, a 3. görbe 50%-os túlélési arányt és a 4. görbe 20%-os túlélési arányt mutat. Az elpusztult sejtek számát a b = n-l/2‘/gt képletből számítjuk, ahol n = az eredeti tenyészet aránya (1.000), l - a 0-szint meghaladásáig eltelt idő ( to*, ti, la * ), gt = generációs idő (ti-to). A 2. ábrán az 5. jelű görbe nem gátolt növekedésnek, a 6. görbe baktericid hatás alatti növekedésnek (50%-os pusztulási arány), a 7. és 8. görbe nem szétboinló bakleriosztatikus hatás alatti növekedésnek és a 9. görbe lebomló bak teriosztatikus hatás alatti növekedésnek felel meg. A 3. ábrán li-lo( = a) jelenti a növekedési faktor részvételét, A diauxiás növekedésből a következő tényezőket határozhatjuk meg: 1) A minta toxicitása, az 1 logaritmikus fázis kiindulási pontjától (1. ábra). 2) A minta toxicitásának természete (baktericid, bakteriosztatikus, szétbomló bakteriosztatikus, az I logaritmikus fázis növekedési formájából (2. ábra). 3) A vissza nem alakult sejtek növekedési sebessége, az I logaritmikus fázis növekedési görbéje szög-faktorának nagyságrendjéből (3. ábra). 4) A visszaalakult sejtek növekedési sebessége, a II logaritmikus fázis szög-faktorának nagyságrendjéből (3. ábra). 5) A mintában jelenlevő (ha egyállaln van jelen) növekedési faktorok, az elnyelés nagyságrendjéből az 1 plató-állapotban. A növekedési faktorok által okozott extra visszaalakult sejtek számát az Fp = = 2*'1 x g x r képletből számítjuk ki, ahol a betűk jelentése a következő: Fp = az extra növekedési faktor felh isználása utáni extra visszaalakult snjtek, g = a sejt-generációk száma, r = a visszaalakult sejtek száma generációnként, szorozva a populáció méretűvel; 10 = f- fölösleg kiindulási szintje — Di—Do — s 11 = a fölösleg végső szintje = Di-Do g ~ a sejt-generációk száma = E i—Do/Da = ki/ks«—to— ki/ts-t 6) A minta mutagén hatása, az I plató losBzából (3. ábra). 7) A visszaalakult sejtek száma lo időpillanatban, a II és I logaritmikus fázis extrapolációjának felhasználásával. I; = a végső populáció észlelt mérete, e = ki/ts-to = az osztódások száma az I logaritmikus fázisban, b = ka/tn.a-ts az osztódások száma az I plató fázisban és a II logaritmikus fázisban, x = a visszaalakult sejtek száma to időpontban X = D/2a + 2",b A vizsgálat végrehajtásának általános ismer7 tetése Növesztő tápközeg 965 pl Bakttriumsejtek 5 pl Minta 10 pl Metabolikua aktiváló rendszer (S-9) 20 pl (ha kell). Növesztő tápközegként általában a fentiekben már említett Davis-Mingioli vagy Vogel-Bonner tápközeget használjuk. A metabolikus aktiváló rendszert (S-9), amely a promuta jeneket mutagénekké aktiválja, Ames és műnkatársai ismertették (Mutation Research, 113., 186-191. és 207. oldal, 1983.), alkalmazásukat pedig Frantz és Mailing írták le a Mutation Research, 31., 365-380., 1975. irodalmi helyen. A fenti komponenseket 1 ml-es küvettában összekeverjük, rázóval 15 másodpercig keverjük, 37 ®C hőmérsékletű inkubátor-dobozba helyezzük, FP 901-ben 405 nm-en nullázzak, majd 20-24 óráig inkubáljuk, mialatt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
