190002. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-izomeráz- aktivitással rendelkező mikróbasejtek immobilizálására
190002 A jelen találmány tárgya eljárás glükóz-izomeráz-aktivitással rendelkező mikrobasejtek immobilizálására úgy, hogy egy fehérjehordozó jelenlétében glutárdialdehiddel kiváltott kopolimerizációt végzünk. Ismeretes, hogy az olyan mikrobasejtek immobilizálására vonatkozó eljárásoknak, melyek sejten belüli glükózizomeráz-aktivitással rendelkeznek, egy idő óta, az immobilizált preparátumnak, a glükóz-izomeráz-szirupok előállításában történő ipari felhasználása miatt az élelmiszer- és az élvezeti cikk iparban nagy jelentőséget tulajdonítanak. Enzim preparátum használata lehetővé teszi magas fruktóz tartalmú szirupok folyamatos eljárással történő előállítását. Eredetileg tiszta enzimpreparátumokkal dolgoztak, amelyeket többek között DEAE-cellulózra (Thompson C. M., Johnson R. A., Iioyd N. E., 3788945 sz. USA szabadalmi leírás, 1974. jan. 29.) amberlight-re (Thompson C. M., 3909354. sz. USA szabadalmi leírás, 1972.), poliakrilamid-gélre [Kazumi T., Kawashima K., Tomura N.: J. Ferment. Technoi. 52, 5,321 (1974)],magnéziumoxidra (Eaton D. L., Messing R., 3705084. sz. USA szabadalmi leírás, 1972. jan. 12.), kolagénre és más fehérjeanyagokra (Messing R., 3705084. sz. USA szabadalmi leírás, 1972. jan. 12.), alumínium-oxidra [Vieth W. R., Wang S.S., SainiR.: Biotechnoi. Bioeng. 15,565 (1973)] immobilizáltak. Minthogy a glükóz-izomeráz egy endoenzim, az előzetes extrakdóia és tisztítása nem bizonyult rentábilisnek, így az immobilizált preparátum előállítására alkalmazott eljárás komplikált és drága lett. Ilyen megfontolásból végeztek kísérleteket az immobilizált preparátumnak az egész mikrobasejtből történő előállítására, amelyet a gyakorlatban egyre szélesebben alkalmaznak. Lloyd és munkatársai (Lloyd N. E., Lewis, L. T., Logan R. M., Patel D. N,, 3694319. sz. USA szabadalmi leírás, 1970.) termikusán kezelt teljes Arthrobacersejteket alkalmaztak glükóznak folyamatos eljárásban történő fruktózzá alakításához. Amotz és munkatársai szabadalma (Amotz Sh., Kjaer T., Nielsen N., Thiesen O., 3950521. sz. dán szabadalmi leírás, 1976.) szerint teljes Bacillus sp. NRLL 5656 sejteket glutárdialdehiddel kezeltek, és a polimerizált preparátumot használták izomerizálásra. A glutárdialdehid alkalmazásának az az előnye, hogy a reagens és a reakciótermékek nem toxikusak, és az eljárással elég magas enzimatikus aktivitással rendelkező terméket kapnak. Az eljárás további előnye, hogy a sejteket kovalens vegyülettel kötjük össze, amely lehetővé teszi egy megfelelően stabilis termék előállítását. Baxter Láb. szabadalma (Baxter Láb., 1401946. sz. USA szabadalmi leírás, 1973. nov. 15.) szerint a sejtek polimerizálását egy diazotált diamino vegyidet jelenlétében végzik, amely 1-3 heterogyűrűt tartalmazhat, mint például 2,6-diamino-piridin, 3,6-diamino-akrilin. Teljes Actinomycetes-sejtek ionkötésekkel immobilizálhatók (Sipos T., Hill M., 37083972. sz. USA szabadalmi leírás, 1973.). Az ilyen preparátumok hátránya, hogy az immobilizált enzimes preparátumot tartalmazó oszlopok csak rövid ideig használhatók. Megkísérelték glükózizomeráz-aktivitással rendelkező sejteknek vérfrakciókhoz történő kötését (például a Con, Fibrin és mások szerint V frakcióhoz), az így előállított preparátumok 3 azonban nem mutatnak jó aktivitást [Dische Z., Borenfreund E.: J. Biol. Chem. 192,583 (1951); Sipos T., Hill M., 37083972. sz. USA szabadalmi leírás, 1973.] A feladat az volt, hogy kidolgozzunk egy eljárást teljes mikrobasejteknek egy könnyen hozzáférhető és hatékony fehéijehordozó felhasználásával történő immobilizálására abból a célból, hogy egy olyan immobilizált glükóz-izomeráz-preparátumot állítsunk elő, amely biztosítja magas fruktóztartalmú szirupok folyamatos technológiai eljárással történő előállítását. Immobilizáló reagensként glutárdialdehidet (1-50%os vizes oldat) használtunk. Teljes sejteknek glutárdialdehiddel végbemenő közvetlen polimerizációja az enzimatikus aktivitás nagymértékű elvesztéséhez és a kapott termék nem kielégítő stabilitásához vezet. Megállapítottuk, hogy a teljes mikrobasejtek enzimatikus aktivitása megmarad, ha a glutáraldehides polimerizációt vérszérum vagy vérplazma fehérjehordozó jelenlétében végezzük. A vérszérumnak vagy a vérplazmának, amelyet egészséges vágóállatokból (szarvasmarha és kisállatok, disznók stb.) nyerünk, meg kell felelnie az állategészségügyi követelményeknek, és hűtött, fagyasztott vagy szárított állapotban használjuk. A kopolimerizáció után kapott anyagot vízzel öblítjük. Ebben az állapotban vagy — 10 °C-ra történő fagyasztás után préseljük, azután granuláljuk, majd legfeljebb 50 °C-on vákuumban vagy száraz levegőáramban szárítjuk. A granulált formán kívül a száraz preparátumot meg is őrölhetjük, és azután megszitálva használhatjuk, amikoris a 10—30 mesh méretű szemcséket elválasztjuk. Az előállított glükóz-izomeráz-aktivitású immobilizált preparátumot reakciókolonna megtöltésére használjuk, amelyen egy aktivátorokat (magnézium és kobalt ionokat, az adott enzim számára optimális koncentrációban) tartalmazó 2—3 mólos glükózoldatot 60-75 °C-on átengedünk. Az áramlási sebességet úgy szabályozzuk, hogy a glükóz mintegy 40—50%-ban fruktózzá alakuljon (izomerizációs egyensúlyi reakció). A reakciókolonnában a glükóz-izomeráz-aktivitás és az enzimpreparátum élettartama az enzim és a szubsztrátum érintkezési időtartamának (áramlási sebesség az oszlopon keresztül), az alkalmazott hőmérsékletnek, a felhasznált preparátum aktivitásának és mennyiségének és a jelenlevő aktivátoroknak (magnézium vagy kobalt ionok) a függvénye. A glükóz-izomeráz-aktivitást egy reakciókészülékben a Thompson és munkatársai által leírt eljárással határozzuk meg (Thompson C. M., Johnson R. A., Lloyd N. E., 3788945. sz. USA szabadalmi leírás, 1974. jan. 29.). A fruktózzá átalakított glükóz mennyiségét Dische és munkatársai [Dische Z., Borenfreund E.: J. Bioi. Chem. 192, 583 (1951)] szerint kolorimetriásan vagy polarimetriásan határozzuk meg. Ezt a meghatározást az oszlop működése alatt meghatározott időnként elvégezzük. Az oszlop aktivitási indexét az alábbi képlettel határozzuk meg (Thompson C. M., Honson R. A., Lloyd N. E., 3788945. sz. USA szabadalmi bejelentés): izomeráz-aktivitás = RIE • log [0,504/0,504 - I] I. képlet 4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
