190002. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-izomeráz- aktivitással rendelkező mikróbasejtek immobilizálására
190002 Ebben a képletben I: a fruktózzá átalakult glükóz mennyisége (g-ban), R: az áramlási sebesség ml/perc, E: az oszlopban levő glükóz-izomeráz-aktivitás nemzetközi egységben kifejezve. Az izomerizációs reakció egyensúlyi helyzetét akkor lehet elérni, ha az oszlopban minimum 2000 nemzetközi giükóz-izomeráz-aktivitás-egység van. A reakció melléktermékeit és a kobalt és magnézium ionokat aktívszenes kezeléssel és kationcserélő gyantával, Vofatittal, Duolittal, Amberlight-tel, Dowex-szel és egyebekkel (a magas fr|iktóztartalmú szirup szárazanyag tartalmának mintegy '■ Vos veszteségével) távolíthatjuk el. A magas fruktóztartalmú szirup színindexét spektrofotometriásán, egy 1 m3-es spektrofotmetriaí küvettában, 450 és 600 nm-es hullámhossznál határozzuk meg. A magas fruktóztartalmú szirup színegységeit a következő képlettel határozzuk meg. (Thompson C. M., Johnson R. A., Lloyd N. E., 3788945. sz. USA szabadalmi leírás, 1974. jan. 29.): színindex - 10^(A4^—A6°0) II ltéplet Ebben a képletben A450 - A600 a fényabszorpciókat jelentik, C: az oldatkoncentráció [g/100 cm3]. A találmány tárgyát képező eljárást az alábbi példákon szemléltetjük: 1. példa A mikróbasejtek fermentációja után kapott tápoldatot centrifugáljuk és szűrjük. A leszűrt biomasszát egyszer vízzel öblítjük. A centrifugálás vagy a szűrés után kapott nedves sejtek szárazanyagtartalmának 10-12%nak kell lennie. Ha ettől ez értéktől eltérés van, a megfelelő korrekciót a használt vérszérum vagy vérplazma mennyiségénél is figyelembe kell venni. A friss biomaszszát frissen nyert vérszérummal vagy vérplazmával (1:1)től (1 :10)-ig terjedő súly/térfogat arányban elkeverjük, úgy, hogy a preparátum a polimerizáció után 150—200 Giu/g szárazanyag glükóz-izomeráz-akíivitású legyen. Szárazanyagkilogrammonként 380-400 cm3 25%-os vizes glutárdialdehid-oldatöt adunk a reakcióelegyhez, majd mintegy egy órán át mechanikus keverővei, szobahőmérsékleten keverjük. A kapott polimerizált terméket szűrjük, és többször vízzel öblítjük mindaddig, amíg az öblítővíz már nem színeződik sárgára. A felesleges vizet kipréseljük, majd a preparátumot 12 óra alatt — 8 — — 10 °C-on befagyasztjuk. Ezután a preparátumot hagyjuk megolvadni, az elvált vizet préseléssel eltávolítjuk, és a preparátumot granuláljuk, majd legfeljebb 50 °C-on vákuumban vagy szárazlevegő áramban szárítjuk. A granulált formán kívül a preparátumot 10—30 mesh szemcsenagyságúra őrölhetjük és szitálhatjuk, és így is felhasználhatjuk. 5 2. példa A glükóz-izomeráz-aktivitással rendelkező teljes sejtek vérszérummal vagy vérplazmával végrehajtott polimerizációja során az első példa szerint járunk el. A préselés után az előállított terméket nem fagyasztjuk meg, hanem közvetlenül granuláljuk, majd az 1. példában megadott módon megszárítjuk. 3. példa A glükóz-izomeráz-aktivitással rendelkező sejtek kopolimerizációját porlasztással szárított vagy liofilizált vérszérum vagy vérplazma felhasználásával végezzük. A vérszérumot és a vérplazmát előzetesen vízben oldjuk úgy, hogy a szárazanyagtartalom 8—12% legyen. Ezt követően az 1. és a 2. példában megadott módon járunk el. 4. példa A glükóz-izomeráz-aktivitással rendelkező teljes mikroba sejtek kopolimerizációja során úgy járunk el, mint az 1., 2. és 3. példában, azzal a különbséggel, hogy fagyasztott vérplazmát vagy vérszérumot használunk. Ez esetben a fagyasztott vérszérum vagy vérplazma tömböket legfeljebb 55 °C-on hagyjuk megolvadni. Ezután meghatározzuk az előállított termék szárazanyagtartalmát, és úgy járunk el, mint az 1. és a 2. példában. J. példa Az előállított száraz preparátumot 12 órán át egy, az adott enzim számára optimális kobalt és magnézium koncentrációjú, 2 mólos glükóz-szirupban vagy vízben, 1:10 súly/térfogat arányban áztatjuk. A megduzzadt preparátummal megtöltünk egy oszlopot, amelynek során arra kell ügyelni, hogy az oszlopot jól, egyenletesen, légbuborékok bezárása nélkül töltsük meg. A reakció véghezmeneteléhez szükséges enzimpreparátum mennyiségét az I. képlettel határozzuk meg. Az oszlopon folyamatosan egy 2—3 mólos glükózszirup megy át. Az oszlop végén a fruktóz-koncentrációt kolorimetriásan vagy polarimetriásan határozzuk meg. A glükóz-szirup átalakulási szintjét 40—50%-on tartjuk, azt a kolonnát, amelynek aktivitása 20% alá esett, kicseréljük. Azért, hogy a kolonna mikrobás szennyeződését elkerüljük, ajánlatos az izomerizációs folyamat hőmérsékletét az alkalmazott immobilizált preparátum termostabilitásától függően, 60-75 °C között tartani. A kolonnán az áramlási sebességet egy megfelelő szivatytyúval szabályozzuk, és ez az alkalmazott preparátum mennyiségének és aktivitásának függvénye, az I. képletnek megfelelően. Egy adott kolonna működési időtartama az immobilizált preparátum kezdeti aktivitásától és az alkalmazott glükóz-izomeráz-enzim hőállóképességétől függ. Az, hogy a magas fruktóztartalmú szirupot a kolonnán történő átfolyatás után kell-e aktív 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
