189998. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására
1 2 Az állatokat a JM-sejtsor sejtjeivel immunizáljuk. Első Immunizálás: az első napon, az állatok fülvénájába adott iv. injekcióval, 80-100.10® sejtet tartalmazó 3 ml sejtszuszpenzióval. Második immunizálás: a 14. napon a fentiekben leírt módon. Harmadik immunizálás: a 17. napon, a fentiekben leírt módon. Kivéreztetés: a 21. vagy a 22. napon, érzéstelenítést közben végzett szívpunkcióval. Érzéstelenítés: intravénásán beadott 37 mg/testsúly kg nembutallal (5-etil-5-(l'-metil-butil)-barbItur- 5&V. Szívpunkció: 180/1,8 K-kanüllel és 50 ml-es E-fecskendővel, 100 ml-es centrifugaedényekbe, melyek rácsavarható fedővel vannak ellátva. Az egyes vérmintákat egy éjjelen át 4 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a következő napon feldolgozzuk. A kapott vér mennyisége általában véve függ az állatok krától és sólyától, ez a mennyiség kb. 150 miig terjed. III. A nyers szérum készítése Az egyes vérmintákkal végzett további műveletek Centrifugálás, kb. 3000 g, 15 percig, 4-8 °C hőmérsékleten. A szérum leszivatása és második centrifugálása. Az egyes minták betöltése rácsavarható fedéllel ellátott palackokba. Az átlagos hozam kb. 70 ml állatonként. Minták vétele sterilitási és aktivitási vizsgálatokhoz. A szérumot inaktiváljuk úgy, hogy 56 °C hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk 30 percen keresztül. Az egyes mintákat -18 °C hőmérsékleten tároljuk. Közbenső vizsgálatok: sterilitási és hatás vizsgálatokat végzünk. A minták egyesítése 250—300 állattól származó szérumot egyesítünk az elvégzett közbenső vizsgálatok eredményétől függően: A kombináció, melyben a perifériás lomfocitákka a KBR-titere (komplentkötési reakció) 1:256 vagy ennél több, B kombináció, melyben a perifériás lomfocítákkal a KBR-titer 1:64 és 1:128 közötti, C kombináció, ahol a perifériás limfocitákkal a mért KBR-titer 1:64-nél kevesebb. A hemagglutinációs titer rendszerint nem több az 14000 értéknél. A fenti A és B kombinációt ezután összekeverjük oly módon, hogy az egész títere ne legyen 1:256 értéknél alacsonyabb. A C kombinációt (ez az egyes minták 10—20%-át jelenti) kiöntjük. Az egyesített szérumokat 500 ml-es palackokba töltjük és -18 °C hőmérsékleten tároljuk. A következő közbenső vizsgálatokat végezzük a) Minden egyes palack sterilitás vizsgálata, b) Az A, B és C szérumkombinációk KBR-titerének meghatározása. Ezen közbenső vizsgálatok után a palackokba töltött szénimkombinádókkal végezzük az eljárás további fázisait. IV. Abszorbensek készítése A placcntával végzett műveletek A kórházból kapott friss emberi méhlepényeket az alábbi műveletek elvégzéséig fagyasztott állapotban tartjuk. A fagyasztott placentát fokozatosan hagyjuk felengedni és n nátrium-klorid-óldattal alaposan mossuk. Ezután a köldökzsinórt és a fasciát eltávolítjuk. Hepatitis-tesz céljára a köldökzsinórból vérmintát veszünk. A placentát feldaraboljuk, majd egy turmixberendezésben pépesítjük. A homogenizátumot hűtött centrifugában 15 percig centrifugáljuk (3000 g), majd három ízben n nátrium-klorid-oldattal rfiossuk, végül 500 ml-es palackokba töltjük. Bakteorológiai vizsgálat céljából mintát veszünk és azt a közbensovizsgálatok befejezéséig -18 °C hőmérsékleten tároljuk. Közbenső vizsgálatok: a) Sterilitás és b) májgyulladást okozó vírusok vizsgálata. Eritrocita-koncentrátum A mosott, steril vörösvérsejt-koncentrátumot vérbankokból szerezzük be, ahol azt előzetesen megvizsgálták. V. További műveletek a nyers szérumkombinációval 1 a végtermék kinyeréséig 1. Abszorbensek a) Abszorpció a piacén tán A fagyasztott állapotból kiengedett placenta-homogenizátumot újból centrifugáljuk és mossuk. Az üledéket mérjük. Az abszorpciós arány: 1 rész placenta és 6 rész szérum. A szérumot ráöntjük a placentapépre, majd ezeket fél órán át rázzuk, utána centrifugáljuk. A nem abszorbeált szérumból álló felülűszó folyadékot eltávolitjuk és a következő abszorpcióhoz eltesszük. A közvetlen hemagglutináció céljára mintát veszünk, a titer rendszerint 1512. b) Abszorpció az eritrocitákon Vérbankból friss, mosott, steril eritrocita-koncentrátumot kapunk zacskóban, amelyet azonnal felhasználunk. Két abszorpciós műveletet végzünk, az arány: 1 rész eritrocita és 5 rész szérum. Az eritrocitákat óvatosan adjuk a szérumhoz. A keveréket ugyancsak óvatosan összerázzuk, majd 1,5 órán át 37 ”C hőmérsékletű vízfürdőben inkubáljuk, miközben 10 percenként összerázzuk. A fenti keveréket ezután egy hűtött centrifugában 15 percig 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülűszó folyadékot újból egy abszorpciós kezelésnek vetjük alá. Az abszorbeált szérum mennyisége körülbel ugyanannyi, mint a nyers szérum kezdeti mennyisége. A hemagglutinációs titert mindegyik abszorpciós művelet után meghatározzuk. Ennek értéke az első abszorpció után 1:128 és 1:64 között, míg a második abszorpció után 1:8 és 1:4 között van. 2. Ammónium-szulfáttal végzett kicsapás és dialízis Az abszorbeált szérumot azonos mennyiségű injekciós célokra alkalmas vízzel (Ampuwa) összekeverjük. Ezután lassú ütemben hozzácsepegtetünk olyan steril, telített ammónium-szulfát oldatot (NH^SO*, amelynek pH-ját ammónium-hidroxiddal 7,2 értékre állítottuk be. Az arány: 100 rész hígított szérumra 82 rész fenti ammónium-szulfát-oldat. A kicsapást ügy végezzük, hogy egy éjjelen át keverjük a fenti elegyet. A csapadékot 30 percig tartó centrlfugálással (5000-6000 g) elválasztjuk és a felülúszó folyadékot 189.998 5 10 15 20 26 30 35 40 45 50 55 60 3
