189998. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására
189.998 leöntjük. A csapadékot ezután három Ízben, 45%-os ammónium-szulfát-oldattal mossuk. A végső csapadékot a nyers szérum kezdeti menynyiségének felével együtt 8,0-8,1 pH értékű trisz-HCl-pufferben oldjuk. Ezt az oldatot dializiszsákokba töltjük és trisz-HQ-puffer-oldattal 24 órán át dializáljuk, miközben a pufferloldatot négyszer cseréljük. Ezután a globulinfrakciót 500 ml-es palackokba töltjük és -18 °C tároljuk. Sterilitási vizsgálat céljából mintát veszünk. 3. Ioncserélő kromatográfia A kromatográfiás oszlopot cellulózzal töltjük meg és trisz-HCl-pufferoldattal egyensúlyba kezeljük (sterilezzük). Az oszlop bemenete 'elé egy steril szűrőt csatlakoztatunk. A dializált globulinfrakciót tartalmazó mintátszivattyű segítségével felvisszük az oszlopra, majd azt 8,0-8,1 pH-jú 0,05 mólos trisz-HCl-pufferoldattal eluáljuk. Az első csúcs az egyéb immunglobulinokkal szennyezett IgG:ezt összegyűjtjük és 0,9%-os nátrium-klorid-oldat hozzáadása után betöményítjük. 4. Ultraszűrés Az ioncserénél kapott első frakciót egy Diaflo Hollow Fiber Apparatus (Amicon) berendezésben végzett ultraszűrés útján betöményítjük, emellett a visszatartási határérték: 50.000 M. Az eluátumot legalább 25 mg/ml proteinkoncentrációig töményítjük be, amit spektrofotométerrel határozunk meg 280 nm hullámhosszon. Az immunglobulint a kiindulási mennyiségre számítva kb. 50%-os kitermeléssel kapjuk meg. A legnagyobb veszteség az oszlopon végzett frakcionálás során lép fel. 5. Dialitis, ultracentrifugálás, sterilre szűrés Az ultraszűrést követően a koncentrátumot dializiszsákokba töltjük és ezeket 7,0 pH-jú,foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldattal dializáljuk. A dialízist 24 órán át 4 °C hőmérsékleten végezzük és a pufferoldatot 4 alkalommal cseréljük. A nagy komplexmolekulák, valamint a zsírmolekulák eltávolítása céljából a már dializált proteinoldatot 60 percig 18,000 fordulat/perc sebességgel (kb. 50,000 g) centrifugáljuk. A globulinoldatot ezután sterilre szűrjük. Ezt a műveletet acélból készült nyomásálló edénybe, a környezetinél nagyobb nyomású nitrogénatmoszférában végezzük egy redőzött membránkapszulában (membránszűrőben), melynek pórusmérete 0,22 /um és buborékpont-tesztnek (bubble point test) volt alávetve. A globulinoldatot ezt követően 20 ml/ml proteintartalomra beállítjuk, majd 500 ml-es palackokba töltjük és ezeket a kisebb edényekbe történő szétosztásig hűtőszekrényben tároljuk. A közbenső vizsgálatokhoz mintát veszünk. 6. Letöltés A globulinoldatot üvegből készült, 5 ml-es és 10 ml-es üvegedényekbe töltjük és ezeket gumidugóval és alumínium-zárólemezzel látjuk el., Ezeket az edényeket közvetlenül a betöltés előtt autoklávban sterilezzük. A letöltés előtt a töltőberendezés esetleges fertőzöttségét ellenőrizzük (letéphető lemezek, levegővel bejutott csírák meghatározása). A letöltés előtt azt a helyeiséget, ahol ezt végezzük, egy éjjelen át porlasztott formaiinnal ferőtlenítjük. A letöltéshez használt csöveket autoklávban végzett hőkezeléssel sterilezzük. S terilitási tesztek: sterilizációs tesztcsík, autoklávozási tesztcsík, bioindikátorok, hőmérséklet mérése. A proteinoldatot a letöltést közvetlenül megelőzően még egyszer sterilre szűrjük, majd automata töltőberendezéssel (Perfill) letöltjük. A gumidugót és a fémből készült záróelemet jelenleg még kézzel helyezzük el, majd azokat egy pneumatikus perembehajtó szerszámmal rögzítjük. A letöltési művelet közben a végső vizsgálatok és az újrabeállítás céljából mintákat veszünk. A terméket 4 C hőmérsékleten karantén hűtőszekrényben tároljuk. Ebből a terméket kivesszük és 4 C-on tároló hűtőszekrényben tartjuk. Ellenőrző vizsgálatok az eljárás egyes fázisaiban I. A sejtvonal vizsgálata A T-antigén kvantitatív meghatározására: spontán rozetta-tesztet alkalmazunk. II. A házinyulak vizsgálata Az állatok állatorvosi felügyelet alatt állnak (dr. Thimel-Baumer) a szérumokra és vakcinákra vonatkozó rendelet 15. szakaszában levőelőírásoknak,megfelelően. Kivéreztetés után az állatokat boncolás céljából a Bajor Állategészségügyi Intézetnek adjuk át. III. Közbenső termékeken végzett vizsgálatok 1. ) Az egyes házinyúlszérum-minták a) Sterilitási vizsgálat (baktériumok, gombák). b) Fajlagos hatás vizsgálata (kimplement-kötési reakció). c) Toxicitás vizsgálata emberi vörösvérsejtekkel (közvetlen hemagglutináció), 2. Abszorbensek a) Plaxenta: 1. Májgyulladást okozó vírusok vizsgálata (HbsAG-RlA), Pettenkofer- Intézet 2. Sterilitási vizsgálat. b) Mosott eritrocita-koncentrátum: Májgyulladást okozó vírusok és sterilitási vizsgálat (a vérbank végzi). 3. ) Az ammónium-szulfáttal végzett kicsapást és a dialízist követően végzett sterilitási vizsgálat. 4. ) Pirogén anyagok vizsgálata in vitro az oszlopon végzett frakcionálás előtt és után. IV. A végtermék vizsgálata a letöltés előtt 1. Sterilitási vizstálat a Ph. Eur. (Európai Gyógyszerkönyv) előírásainak megfelelően. 2. Ártalmatlansági vizsgálat (Limulus-teszt-pyrogenitás) vizsgálata. 3. A hatás vizsgálata Komplementkötési reakció Proteinmeghatározás. V. A végtermék vizsgálata széttöltés után (szabálytalan időközökben vett mintákból) 1. Sterilitási vizsgálat a Ph. Eur. (Európai Gyógyszerkönyv) előírásainak megfelelően (Fresenius A.G. (Bad Homburg) bakterológiai kísérleti laboratóriuma) 2. Vírusok vizsgálata Szabálytalan időközökben vett minták vizsgálata, Max-von-Pettenkofer-Intézet, München 3. Ártalmatlansági teszt Pirogenitási vizsgálat házinyulakon (Ph. Eur. Európai Gyógyszerkönyv bakteriológiai kísérleti laboratóriuma, Bad Homburg) Lumulus-teszt (Pyrogenitás) - Bad Homburg és Grafelfingg 4. Hatás és azonossági vizsgálat Rozetta-gátlás Limfotoxicitási vizsgálat (Haematológiai Intézet, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
