189998. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására
189.998 A találmány anti-T-Umfoclta-globulin előállítási eljárására vonatkozik. A nagy hatású immunszupresszív anyagokat a szervátültetéseknél arra használják, hogy megakadályozzák velük a transzplantátum kilökődését, továbbá a csontvelő átültetés után az átültetett szerv megbetegedése a szervezetben (graft versus host) hatás ellen alkalmazzák. Ezeket a hatóanyagokat napjainkig úgy állították elő, hogy állatok - mint pl. lovak vagy házinyulak - szervezetébe injekcióval limfatikus sejteket fecskendeztek, be, majd az immunizált állatok szérumából az anti-limfocita-globulint kinyerték. Az eljárás hátránya az, hogy lomfatikus sejteket kell használni, ezek beszerzése bizonyos etikai problémákat vet fel és csak korlátozott mértékben álnak rendelkezésre. A találmány célkitűzése immunszupresszív hatóanyagok előállítására szolgáló eljárás kidolgozása, melynek során in vitro tenyésztett sejteket használunk fel. Azt találtuk, hogy a JM-sejtsor sejtejeiből kiváló hatásó immunszupresszív hatóanyagot lehet előállítani. A JM-sejtsor előállítása és tulajdonságai Scheider, U., Schwenk H.U. és IBerrikamm publikációjából (j. Cancer 19, 6210626 /1977/) ismertek. A JM- sejtsort az Institut Pasteur Collectrion Nationale de Culture des Microorganismes-nél (C.N.C.M) 1-147 szám alatt deponáltuk. A sejteket tetszés szerint lehet szaporítani in vitro anélkül, hogy tulajdonságait elveszítenék. Az alábbiakban példát ismertetünk az anti-T-limfodta-globulin előállítására, melynek során JM-sejtsor ba tartozó T-limfoblaszt sejteket használunk. A globulint előnyösen a következő lépésekben állítjuk elő: ELŐÁLLÍTÁSI EUÁRÁS I. Antigének előállítása (sejtek tenyésztése) Limfoblasztoid T-sejteket (JM-sejtsor) tenyésztünk szuszpendált tenyészetben. Táptalaj: RPMI-1640 közeg, amelyhez még magzati borjúszérumot, újszülött borjak szárumát, emberi szérumot továbbá sztreptimicint, penicillint és L-glutamint adunk. Optimális hőmérséklet: 37 °C. Optimális pH-érték: 7,2 —fenolvörös Indikátor). Normális szaporodási sebesség: a sejtszám 48 óránként megkétszereződik. A sejteket minden 48. órában megszámoljuk és számukat milliliterenként 0,5 millióra állítjuk be. Az élettelen sejtek száma a 10%-ot nem haladhatja meg. A többlet-sejteket eltávolítjuk, majd centrifuáljuk 1000 dord/perc forgási sebességgel 10 percen át, háromszor mossuk és immunizálásra felhasználjuk. Mosáskor és immunizáláskor használt oldat: Leibowitz közeg (L-l 5). Immunizáló dózis názinyúlra: 100.106 sejt/3 ml Leibowítz-L-15 közeg. Az immunizáláshoz használt sejtek (szabályozott. fagyasztása Az összes eltávolított többlet-sejtet három ízben L-l 5 közeggel mossuk, majd 10%-os dimetil-szulfoxid-oldat hozzáadása után -90°C hőmérsékleten fagyasztjuk. Ezt automatikusan vezérelt fagyasztóberendezésben végezzük, ahol a hőmérséklet precenként 1 °C-kal csökken. Immunizáláshoz ezeket a fagyasztott sejteket 37 °C hőmérsékleten hagyjuk kiengedni és ezt követően azonnal mossuk a DMSO eltávolítása végett. Az első immunizálásra kizárólag friss sejteket használunk, míg az immunnizálás megerősítésére (azaz a további immunizáláshoz) a fagyasztott sejtek is alkalmasak. A továbbtenyésztéshez szükséges sejtek fagyasztása Ezeket a sejteket cseppfolyós nitrogénben fagyasztjuk, az előkezelést a fentiekben leírtakkal azonos módon végezzük. 3—4 hónaponként az ilyen módon fagyasztott sejtekegy részét további tenyésztéshez felolvaszjuk. Érre azért van szükség, mert a szaporodó sejtvonal megváltozhat, és/vagy a felületi T-antigént elveszti (ezt spontán rozetta-teszttel ellenőrizzük). A szükséges közegek elkészítése 1. ) RPMI-1640 közeg Az RPMI-1640 közeget Moore, G. E, és társai írták el, (J.A.M.A. 199,519 /1967/) A közeg elkészítéséhez alkalmas poralakú készítményt a Fresenius cég (Bad Homburg) állít elő és azt I x 10 liter folyékony közeg elkészítése« alkalmas kiszerelésben hozza forgalma (Dr. Kempf). Az említett poralakú készítményt hűtőszekrényben kell tárolni. A poralakú készítmény 10 liter injekciós célokra alkalmas vízben (aqua ad injection, Ampuwa) oldjuk, 20 g nátrium-hidrogén-karbonát hozzáadásával. Az oldat pH-értékét 1 n sósav hozzáadásával? ,05-re beállítjuk, majd keverjük. Ezután sterilre szűrjük, végül 500 ml-es palackokba töltjük. A palackokat 37 °C hőmérsékleten 5 napon át inkubáljuk és terilitásukat ellenőrizzük. Az inkubálás után a palackokat 6-8 °C hőmérsékleten hűtőszekrényben tároljuk. 2. ) L-l 5 Leibowitz-kőzeg A fenti L-l 5 közeget Leibowitz A. és társai írták le, Am.J. Hyg. 78, 173/1963/). A közeget az immunizálásra szolgáló sejtek szuszpendálására használjuk. A poralakú készítményt a Dynatech vállalattól (Plochiger) lehet beszerezni. Ezt a poralakú készítményt 10 liter injekciós célokra alkalmas vízben (Ampuwa) oldjuk. Az oldatot sterilre szűrjük, majd 500 ml-es palackokba töltjük, inkubáljuk és hűtőeszekrényben tároljuk. II. Ántiszérum előállítása A nyulak immunizálása és kivéreztetése A szérumokra és a vakcinákra vonatkozó 1972. november 14-i rendelet előírásainak (15. szakasz) megfelelően az állatok elhelyezése az alábbi módon történt: Első ól: Raucherberg-nél (8121 Wielenbach), bérlő a Fresenius cég. Felügyeslő állatorvos: Dr. Iheimel-Baumer (Fresenius A .G.). Ellnőrző körzet állatorvos: Dr. Hanfstingl, Állami Állategészségügyi Hivatal, 8120 Weilheim. Boncolás: Bajor Állategészségügyi Intézet (Tiergesundheitsdienst Bayern e.v.), 8011 Grub (München mellett), Senator Gerauerstrasse 23. Második ól: Dr. Ivanovas GmbH, amelyek kísérleti állatok tenyésztésével foglalkozik, 7964 Kisslegg, Allgau. Állatorvos: Dr. Albus. Az immunizálásra, kivéreztetésre és boncolásrá vonatkozó feljegyzéseket készítettünk és azokat megőriztük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
