189979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid antibiotikumok előállítására
1 2 zett fermentációval A Streoptomyces fradia NRRL 12171 Iiofilezett tenyészetét 1-2 ml steril vízbe szuszpendáljuk. 0,5 ml szuszpen7jóval 150 nil, alábbi összetételű, vegetativ táptalajt oltunk: kukoricalekvár 1,0 % élesztőkivonat 0,5 % szójabab dara 0,5 % kalcium karbonát 0,3 % szójabab-olaj fnyers) 0,45% ionmentes víz 97,25% Eljárhatunk oly módon is, hogy az S. fradiae NRRL 12171 vegetatív tenyészetének 1 miét, amelyet előzőleg folyékony nitrogénben tároltunk, felolvasztunk, és ezzel oltjuk a vegetatív táptalajt. A beoltott vegetatív táptalajt 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban tenyésztjük 29°C hőmérsékleten, 48 órán át, percenként 300-at forduló, zárt rázógépben. A kinőtt vegetatív táptalajt 0,5 mi ével 7 ml, alábbi összetételű termelő táptalajt oltunk: répamelasz: 2.0 % kukoricaliszt 1,5 % halliszt 0,9 % kukoricadara 0,9 % nátrium-klorid 0,1 % diammónium-hidrogén -foszfát 0.04% kalcium-karbonát 0,2 % szójabab o’aj (nyers) 3,0 % ionmentes víz 91.36% A beoltott fermentációs táptalajt 50 nd térfogatú lombikokban tenyésztjük 29° C hőmérsékleten, 6 napon át, percenként 300-at forduló, zárt rázógépben. B) A DMOTelőállítása tankfermentorban Nagy térfogatú inokulutn előállítására az A) pontban megadottak szerint 60 ml kinőtt vegetatív táptalajjal 38 liter második fázisú vegetatív táptalajt Viiuniv, niiiwijiivív waat-vwiviv u iwrviiwbu. kukoricalekvár 1,0 % szójaliszt 0,5 % élesztőkivonat 0,5 % kalcium-karbonát 0,3 % szójabab olaj (nyers) 0,5 % lecitin (nyers) 0,015% víz 97,185% A táptalaj pH-ját 50%-os nátrium-hidroxid-oldattal 8,5-re állítjuk be. Ezt a másoák fázisú vegetatív tenyészetet 68 1 térfogatú fermentörban inkubáljuk 47 órán át 29°C hőmérsékleten!, levegőztetés és keverés közben. I Körülbelül 74 1 második fázisú tenyészettel 40 1 térfogatú steril, teímelő táptalajt oltunk, aminek az alábbi az összetétele: halliszt 0,9188% kukoricaliszt 1.575 % kukoricadara 0.9188% kalcium-karbonát 0.210 % nátrium-klorid 0.105 % diammónium-hidrojjén-foszfát 0.04 2 7 répa melasz j 2,10 % szójababolaj (nyers) 3,15 % lecitin 1 0.0,945% víz 90.8859% A táptalaj pli-ját 50%-os nátriuni-hidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk be. A beoltott termelő táptalajt 68 1 térfogatú fermentorban tenyésztjük 5 napon át, 28°C hőmérsékleten. A fermentációs táptalajba steril levegőt vezetünk át olyan mennyiségben, hogy az oldott oxigén koncentrációja 30% és 50% között legyen, a továbbá percenként 250-et forduló, hagyományos keverővei keverjük. 2. példa A DMOT izolálása Az 1. példában megadott módon előállított 7,2 pH-jú tenyészetet szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. 1450 ml szürlethez 400 ni etil-acetátot adunk. Az oldat pHját nátrium-hidroxiddai 9.1- re állítjuk be. 10 percen át keverjük az elegyet, az etil acetátot elkülönítjük oly módon, hogy szűrési segédanyagon át szűrve megszüntetjük a szuszpenziót. 200 ml etil-acetáttal újra extraháljuk a szürletet. Ezután 200 ml vizet adunk az egyesített etil acetátos extraktumhoz, és ennek az oldatnak a pll-ját foszforsavval, 4,i-re állítjuk be. Extrakciót követően elkülönítjük a vizes fázist, a szerves oldószert kiöntjük. 9,1-re állítjuk be nátrium-hidroxiddai a vizes fázis pHját, majd 100 ml térfogatúra töményítjük, csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval. Amorf csapadék képződik. Egy éjszakán át állni hagyjuk a s/.uszpenziót, majd szűréssel elkülönítjük a terméket. Az elkülönített csapadekot 20 ml acetonban oldjuk, az oldathoz 75 ml vizet adunk. Csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk az aeetont. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük, vízzel mossuk, ezután 500 mg DMOT-t kapunk. További 260 mg terméket kapunk, hasonló módon kezelve a szürletet. 3. példa A DMOT izolálása A 2. példában megadott módon előállított DMOT 11 g-ját híg hidrogén-klorid-oldatban oldjuk (addig adunk hidrogén-kloridot vízhez, míg annak pH-ja 1,8 lesz). A kapott oldatot 24 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni, ezután pH-ját nátrium-hidroxiddai, 9,0-ra állítjuk be. A bázikus oldatot kloroformmal extraháljuk. Csökkentett nyomású térben desztilláljuk a kloroformos extraktumot, ezután 9,65 g DMOT-t kapunk. A mellékelt ábrákon bemutatjuk a DMOT szabad bázis kloroformos oldatában felvett infravörös abszorpciós spektrumát. A DMOT fehér színű, amorf, szilárd halmazállapotú termék, amit 158°C hőmérsékleten lágyul és 165—167°C hőmérsékleten olvad. Az elemanalízis adatai a következők: C: 62%, H: 8%, N: 2%, O: 27%, A vegyidet tapasztalati képlete £28^63^12’ m°lel{,1*ás,^ya: ?26 (tömegspektromeiriásan meghatározva: 725). A DMOT kloroformos oldatában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a mellékleteken mutatjuk be. Elnyelési maximumokat a következő frekvenciákon találtunk (cm-l): 3653 (kicsi), 3588 (váll), 3470 (széles), 3026, (váll), 2998 (váll), 2969 (intenzív), 2932 m (intenzív), 2873, (váll), 1709 (intenzív), 1669 (közepes), 1616 (kicsi), 1583 (intenzív), 1447 (közepes), 1400 (közepes). 1364 189 979 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
