189734. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai készlet és alkalmazása dehidrogenázok és/vagy oxidázok kimutatására
1 A találmány tárgya diagnosztikai készlet dehidrogenázok és/vagy oxidázok megnövekedett koncentrációjának kimutatására, valamint e készlet alkalmazása. Minden egyes citoszólos dehidrogenáz esetében, amelyek az emberi, állat vagy növényi szervezetben egy kóros (patológiás) elváltozás során a sejten kívüli folyadékokba átlépnek, ezekben a folyadékokban a kóros küszöbérték empirikusan megállapítható. Egy kóros elváltozás felismerését célzó vizsgálat során a diagnosztizáló rendszer fizikai-kémiai paramétereit úgy kell beállítani, hogy a dehidrogenázok, illetve oxidázok aktivitása a diagnózis körülményei között egy indikátor — például egy redox-színezék - átcsapási pontjával egybeessenek. Sejtmembránok sajátságainak kóros elváltozásakor várható, hogy különböző piridin-függő dehidrogenázok - például a laktát-dehidrogenáz (LDH), alkohol-dehidrogenáz (ADH), glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, izocitrát-dehidrogenáz, glutamát-dehidrogenáz, gjukóz-dehidrogenáz és glukóz-ó-foszfát-dehidrogenáz — és/vagy flavin-függő dehidrogenázok és/vagy flavintól független oxidázok — például a szukcinát-dehidrogenáz, glicerin-3-foszfát-dehtdrogenáz, glukóz-oxidáz - a szérumba és más, sejten kívüli (extracelluláris) folyadékokba átlépnek. Minden egyes dehidrogenázra, illetve oxidázra vonatkozóan található egy olyan küszöbérték, amely a diagnózis szempontjából patológiásnak tekinthető. Ez esetben patológiás elváltozásként például rosszindulatú daganatok keletkezése jön számításba. Egy redox-színezék átcsapási pontjának a mindenkori kóros küszöbértékkel való egyeztetése céljából a diagnosztizáló rendszer fizikai-kémiai paraméterei a következő módon állítható be : a) Az adott dehidrogenáz szubsztrátumát — például LDH esetében laktátot — alkalmazzuk. b) Az alkalmazott szubsztrátum és piridin-nukleotid mennyiségét szabályozzuk. c) A reakció egyensúlyának pH-értékét és ezzel helyzetét - adott esetben egy pufferrendszer segítségével — szabályozzuk. d) Olyan redox-színezéket — például valamilyen leuko-színezéket, amely színtelenből színesbe csap át - választunk, amelynek redoxpotenciálja a diagnózis körülményei között a piridinnukleotid-rendszer redoxpotenciáljánál nagyobb. e) Olyan elektronátvívőt választunk, amelynek redoxpotenciálja a piridinnukleotid-rendszer és a kiválasztott redox-színezék redoxpotenciálja között van. f) Amíg a dehidrogenáz egyensúlya be nem áll, a hosszabb átalakulási időtartam a redukáló piridinnukleotid magasabb koncentrációját eredményezi. Ennek megfelelően a redox-színezéi átcsapási küszöbértéke és így a diagnosztizáló rendszer kimutatási érzékenysége az átalakulási időtartam segítségével szabályozható. g) A diagnosztizáló rendszer céljára különböző hordozók választhatók. A 2 443 741 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás eljárást közöl az LDH izozim-4 és izozim-5 együttes meghatározására, amelynek soTán egy laktátból és nikotinsavamid-adenlndinukleotidból (NAD) álló keveréket a vizsgálandó testfolyadékkal hozunk érintkezésbe. Ha az LDH megnövekedett koncentrációban van jelen, 2 akkor katalizálja a laktátnak a dinukleotiddal a megfelelő piruváttá és a redukált nikotinsavamid-adenindinuldeotiddá (NADH) való átalakulását az a) reakcióvázlat szerint. Az LDH az emberi szervezet sejtjeiben az izoenzim-1, -2, -3, -4 és -5 alakjában van jelen. Meghatározott, specifikus kóros elváltozások során az LDH megnövekedett koncentrációban van jelen, így például a női nemiszervek területén keletkező rosszindulatú daganatok esetében az izoenzim-4 és izoenzim-5 koncentrációja fokozódik. A fentebb idézett szabadalmi leírás szerint a laktát és NAD között végbemenő reakciót 6—6,5 pH értéken kell végrehajtani. Ebből a célból a testfolyadékot és/vagy a laktátot és NAD-ot tartalmazó vizsgáló reagenst — adott esetben egy pufferrendszer alkalmazásával — erre a pH-intervallumra kell beállítani. Azokban az esetekben, amikor egy testfolyadék - például hüvelyváladék - pH-értéke alacsonyabb, például 4- a vizsgáló reagens 6,5 pH-értéket meghaladó értékre állítható be, hogy így a vizsgáló reakció során a kívánt pH-érték 6-6,5 tartományba essék. A b) reakcióvázlat szerint, jobb oldal irányában lefutó reakció egy következő reakció útján láthatóvá tehető. Ebből a célból a vizsgáló reagenst nitrokék-tetrazólium-kloriddal (NBT), és adott esetben fenazin-metoszulfáttal (N-metil-fenazónium-metil-szulfát, 5-metil-fenazónium-metil-szulfát, PMS), mint hidrogénátvivőszerrel, illetve elektronátvivővel elegyítjük. A b) reakcióvázlat értelmében képződő NADH a hidrogénátvivő, illetve elektronátvivő jelenlétében az NBT által NAD-dá oxidálódik, piiközben az NBT a nitrokék-formazánná [4,4 -(3,3 -dimetoxi-bifenilenil)-bisz-2H)-2N -p-nitro-fenil-C-fenil-formazán)] egy kék színezékké alakul, és ennek következtében az enzimaktivitás és az LDH, illetve az LDH izoenzimjeinek jelenléte láthatóvá válik. Az ismert eljárást nők hüvelyváladékának vizsgálatára alkalmazták. A hüvelyváladék és a vizsgáló reagens közötti reakció időtartama előnyösen 15-30 perc volt. Helyben megállapíthatók voltak a női genitális traktus kóros elváltozásai, így például a méhnyakrák, a méhtesti rák, és egyéb ráktípusok. A nők genitális karcinómáinak más eljárásokkal - például citológiai úton vagy kolposzkópiával - végzett szűrővizsgálatai során a méhnyakrák esetében átlagosan 30%-ban hamis negatív diagnózisok adódnak. Ennek során mást nem is ismernek fel, mint a fentebb felsorolt női, nemiszervi karcinómákat. Nagyon kívánatos tehát az az igény, hogy ez a hibaszázalék csökkenthető legyen. A 893 301 számú nagybritanniai szabadalom kolorimetriás vizsgálatot ír le szérum-enzimek meghatározására. Laktát-dehidrogenáznak biológiai folyadékokban való meghatározására egy olyan keveréket adnak meg, amely egy tejsavsót, egy difoszfopiridinnukleotidot (nikotinsavamid-adenindinukleotidot), diaforázt és 2,6-diklór-indofenolt tartalmaz. Az elegy pH-értékének 5 és 9 között kell lennie. Az idézett nagybritanniai szabadalmi leírás szerint 7,0 alatti pH-értéket nyilvánvalóan nem vettek figyelembe. Az előnyösnek megjelölt pH-tartomány ugyanis 7 és 8 között van, és az egyik kiviteli példa szerint 7,4 pH-értéken végzik el az eljárást. A szabadalmi leírás szövegének egy másik helyén közlik, hogy a vizsgálatot egy pufferral gondosan 7-es pH-értékre beállított oldatban hajtják végre. Kitűnt végül, 189 734 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
