189708. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a VIII:C véralvadási faktor előállítására
1 2 mú amerikai szabadalmi leírásban ismertetett módon valamely fenti alkoíd-alkil-aminnal kötjük le. A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott polielektrolit polimereket olyan módszerekkel is előállíthatjuk, amelyek egy aggregációs műveletet is tartalmaznak, lásd például a 4 118 554. számú amerikai szabadalmi leírást. Di-(rövidszénláncú alkil)-amino-rövidszénláncú-alkil-imid-csoportként előnyösen dimetil-amino-propil-imid-csoportot, térhálósító-szerként előnyösen N,N-bsz-(amino-propiI)-meti]-amint, és alkoxi-alkil-aminként előnyösen metoxi-propil-amint használunk. Nyilvánvaló, hogy a polielektrolit polimer adszorbensek előállításának fent leírt módszerei csak a szemléltetést szolgálják, és hogy a vérnek a jelen találmány szerinti, ilyen adszorbensek felhasználásával végzett frakcionálása nem korlátozódik valamely adott módon előállított ilyen polimerek használatára. Jelen ismereteink szerint a jelen találmány szerinti eljárás egyik lényeges vonása, hogy mindkét, polielektrolit polimerrel végzett adszorpciós lépésben exogén heparint alkalmazunk, ugyanis az adszrobens az első adszorpdós lépésben a közeghez hozzáadott exogén heparin jelentős mennyiségét adszorbeálhatja. A második adszorpciós művelet előtt általában annyi heparint adunk a közeghez, amennyit az első adszorpdós művelet eltávolított a közegből. A heparint hozzáadhatjuk a vérhez már a vérvétel során, vagy pedig más alvadásgátló, mint például ACD, CPD vagy CPDA alkalmazásával levett vérhez. A találmány szerinti eljárás egy további előnyös kivitelezési változata szerint a heparint hozzáadhatjuk a plazmához közvetlenül azelőtt is, hogy a plazmához a polielektrolit polimert hozzákeverjük. Ebben az esetbcn a heparin ionos kötésekkel kötődhet a polimerhez, és így a polielektrolit polimer és a heparin komplexe keletkezik. A polielektrolit polimer és a heparin komplexét kényelmesen előállíthatjuk oly módon, hogy heparint és a polimert vizes szuszpenzióban összekeverjük, majd az így kapott komplexet elkülönítjük és megszárítjuk. A kiindulási vérpazma lehet teljes vérpalazma, vagy ennek valamely olyan koncentrátuma, amelyről tudjuk, hogy VIII£ faktort tartalmaz, ilyen például a kriopredpitádós módszerrel előállított koncentrátum A vér frakcionálására szolgáló eljárás adszorpciós műveleteit vizes szuszpenzióban, és előnyösen fiziológiás nátríum-klorid-oldatban végezzük.A közeg pH-ját a kívánt savas vagy bázikus értékre úgy állíthatjuk be, hogy a plazmát az eljárás 1. adszorpciós műveletéhez szükséges 7,0 és 8,5 közötti pH-tartomány elérése céljából nátrium-hidroxiddal, míg az eljárás 3. adszorpdós lépéséhez szükséges 5,5 és 6,5 közötti pH-tartomány elérése céljából sósavval, ecetsavval, vagy előnyösen citromsawal kezeljük. Az egyes adszorpdós lépések után az adszorbeált plazma-fakrdókat szűréssel, centrifugálással vagy más, hasonló elválasztási módszerekkel különíthetjük el a felúszó folyadékoktól. A kívánt VIII,-C faktor koncentrátumot azután úgy állíthatjuk elő, hogy az utolsó adszorpdós művelet után az adszorbent 1 -3 mólos és előnyösen 1,5-1,8 mólos nátrium-klorid-oldattal, vagy valamely más, hasonló, élettanilag elfogadható eluenssel eluáljuk. A VIII:C konoentrátumot részleges sómentesítés és betöményítés (például membrán-ultraszűrés) vagy steril szűrés (például félig-áteresztő, 4 ß pórusméretű membránon át való szűrés); majd fagyasztva szárítás útján átalakíthatjuk valamely élettanilag elfogadható, steril,szilárd formájú készítménnyé. Az elkülönített végtermékben a VIIIC faktor aktivitását önmagában ismert, egylépcsős vagy kétlépcsős olyan módszerekkel határozhatjuk meg, amelyek során aktivált részleges tromboplasztin időt (PTT) mérünk. E meghatározásokban a vizsgált plazmához részleges tromboplasztint adva kimérhetjük a hiányos plazma-faktorok mennyiségét. Előnyösen a Quick által kidolgozott, Ismert, egylépcsős protrombin idő meghatározási módszert alkalmazzuk. Az egylépcsős meghatározási módszerekkel kapcsolatos további informádó2kat lásd Quick Hemorrhagic Dieases (vérzéses betegségek), Lea & Febiger, Philadelphia, Pa., 1957, Langdell és munkatársai, J. Láb. Óin. Med.,41,637 (1953), és Hardisty és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorm., 7,215 (1962). A végtermékben a VIIIR faktor aktivitását aggregádós módszerrel határozhatjuk meg oly módon, hogy a készítményt a risztocetin atíbiotikum hatásának tesszük ki, majd a mérést immun-elektroforézlssel vagy radioimmunassay-vel végezzük el. Alkalmas ilyen meghatározási eljárásokat írtak le Harris és munkatársai, Biochim. Biophys. Acta, 688 , 456470 (1981), és Flucher és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 79, 1648-1652 (1982). Habár a jelen leírásban különösen az emberi vér frakdonálását írjuk le, nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti eljárás segítségével más, állati eredetű vérmintákat is, így például szarvasmarhából, sertésből, lóból vagy birkából származó vérmintákat is hasonló módon lehet frakdonálni. a találmány szerinti eljárást a továbbiakban - a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül — példákkal szemléltetjük. 1. példa Humán donorok (véradók) vérét CPDA-1 alvadásgátlót tartalmazó műanyag vérgyűjtő zsákokba gyűjtjük. A plazmát a vér levétele után 4 órán belül hűtött körülmények között centrifugálva különítjük el. 40 különböző donortól gyűjtött plazma 200-200 ml térfogatú részleteit 300 ml térfogatú vérszállító szákokba mérjük, e zsákokat megfagyasztjuk és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A friss, fagyasztott plazmát szobahőmérsékleten, adszoprdós műveletek olyan sorozatával frakdonáljuk, amelyben adszorbensként exogén heparin jelenlétében két különböző, vízoldhatatlan, térhálósított polielektrolit gyantát használunk. E gyanták etilén és maleinsav-anhidrid molárisán lényegében azonos mennyiségét tartalmazó kopolimerek, 5 mól% NJM-bisz-(amino-propil)-metil-aminnal térhálósítva, és amely kopolimer láncaihoz dimetil-amino-propil-lmino-csoportok kapcsolódnak. Az első gyanta, az A- jelzésű gyanta polimer láncaihoz 90 mól% ilyen csoport kapcsolódik, míg a második gyanta, a B-jelzésű gyanta láncaihoz 5 mól% ilyen csoport kapcsolódik. A b-jelzésű gyantában továbbá valamennyi szabad karboxíl-csoporthoz ésjvagy anhidrid-csoporthoz metoxi-propil-amino-csoportok kapcsolódnak. Használat előtt a B-jelzésű gyantát az alábbi módon előkezeljük: 20 g gyantát 200 ml, 0,1% marha szérum albumint tartalmazó, 0,154 mólos nátrium-klorid-oldatban 189.708 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
