189708. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a VIII:C véralvadási faktor előállítására
1 2 dlszpergálunk (a szarvasmarha szérum albumín helyett használhatunk humán szérum albumint is). A dlszpergálás (3-5 perces keverés) megkönnyítése érdekében az elegy pH-ját 1,0 mólos citromsav-oldattal 4,0-ra állítjuk. Utána a gyantát kiszűrjük és a szürletet elöntjük. A nedves kiszűrt gyantát 200 ml, szarvasmarha szérum albumint tartalmazó nátrium-klorid-oldatban újra diszpergáljuk. A diszperzió pHját keverés közben 1,0 mólos nátrium-hidroxid-oldattal 5,8-ra állítjuk, majd a szuszpenziót további 10 percig keverjük. Ezután a gyantát kiszűrjük, és a kiszűrt, nedves anyagot félretesszük, a frakdonálás során így használjuk fel, A frakdonálás során használt valamennyi eluens és mosófolyadék 0,1% szarvasmarha szérum albumint tartalmaz, amely egyrészt minimálisra csökkenti a kívánt fehérjéknek a felületéhez való kötődését, másrészt stabilizálja a Vili :C faktort. A frakcionáláshoz sertés heparin nátrium-sót alkalmazunk, fiziológiás só-oldatban (0,9%-os nátrium-klorid-oldatban) oldva, koncentrációja körülbelül 200 egység/inl. A frakcionálási eljárást az alábbi módon végezzük: Egy zsáknyi (vagyis 200 ml) friss, fagyasztott plazmát gyorsan felengedünk, oly módon, hogy egy kevert, 37 °C hőmérsékletű vízfürdőbe tesszük. A heparin jelenlétében végzett kísérletekhez használt, felengedett plazmához egy pohárban 1 ml heparin-oldatot (vagyis 200 egységet) adunk, és az elegyet 3-5 perdg keveij4k. Ezután az alvadási vizsgálathoz mintát veszünk a plazmából, és feljegyezzük a minta térfogatát és a mintavétel idejét. A kontroll-kírésleteket úgy végezzük, hogy a plazmához nem adunk heparint, de egyébként mindenben a heparinnal végzett kísérletekkel azonos módon járunk el. A plazmához (vagy heparinnal kezelt plazmához) hozzáadunk 70 mg A-jelzésű gyantát, az elegy pH-ját 1 mólos nátrium-hidroxid-oldattal 8,0-ra állítjuk, és az ezt követő 20 perces keverés során a pH-t ezen az értéken tartjuk. Utána a gyantát kiszűrjük, a VIIIC faktor aktivitás legnagyobb része ekkor a szűrletben van jelen. A kiszúrt nedves gyantát 20 ml desztillált vízben újra felszuszpendáljuk, a szuszpenziót 5 perdg keverjük, a gyantát kiszűrjük, maid a két szűrletet egyesítjük. Az egyesített szűrletből a VIIIC faktor aktivitásának meghatározására mintákat veszünk. A minta térfogatát feljegyezzük, és ebből számítjuk ki a teljes alvadási egységek számát. Ezután a szűrlethez (vagy heparinnal kezelt szűrlethez) hozzáadunk 12 g előkezelt B-jelzésű gyantát, az elegy pH-ját 1 mólos dtromsav-oldattal 5,8-ra állítjuk, és a szuszpenziót 20 perdg keverjük oly módon, hogy ezalatt a pH-t 5,8-on tartjuk. Ezután a gyantát kiszűrjük, és 200 ml, 0,002 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk. Az egyesített szűrleteket félretesszük abból a célból, hogy majd ebből különítsük el az albumint és gamma-globuíint tartalmazó plazma-frakdókat. A kiszűrt gyantát 200 ml 0,3 mólos nátrium-klorid-oldatban diszpergáljuk, a diszperzió pHját 5,8-ra állítjuk, majd a szuszpenziót 5 perdg keverjük. Eztuán a gyantát kiszűrjük, további 200 ml 0,3 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, és a szűrletet elöntjük. A* kiszűrt gyantát 200 ml olyan eluensban diszergáljuk, amely 1,5 mólos koncentrádóban nátrium•kloridot, stabilizálószerként 0,1 mólos koncentrádóban lizint, továbbá 0,1% koncentrádóban szarvasmarha jszérunv albumint tartalmaz. A diszperzió ph-ját 6,0-ra állítjuk, .és a szuszpenziót 20 perdg keverjük. Eztán a gyantát kiszűrjük, adott esetben körülbelül 20 ml eluenssel mossuk, az egyesített szűrlet- és mosófolyadék térfogatát feljegyezzük, és e folyadékból mintát veszünk, az alábbi, I. táblázatban megadott alvadási vizsgálat céljaira. A szűrletet és a mosófolyadékot, amelyben az eredeti VIIIC faktor alvadási aktivitásának körülbelül 40—70%-a van jelen tisztított formában, tovább feldolgozhatjuk, további betöményítés és részleges sómentesítés céljából. Ezt például egy Milli pore Pelllcon ® Cassette szűrőrendszerrel vagy egy Amicon DH 4 üreges-Szálas molekulaszűrő rendszerrel végezhetjük, ez utóbbi rendszerben olyan poliszulfon szálakból Álló membrán van, amely az egyes anyagokat molekulasúly szerint úgy választja szét,hogy csak a kívánt molekulákat tartja vissza. Az így betöményített oldatot ezután fagyasztva száríthatjuk, és a tároláshoz csomagolhatjuk. E további betöinényítési és feldolgozási műveleteket azonban a jelen példában nem végezzük el. Az alábbi, I. táblázatban bemutatjuk a fent leírt eljárással végzett, több frakdonálási kísérletünk eredményeit, amely kísérletekben CPDA-val stabilizált palzmát alkalmatunk. Az eredményekből jól látható, hogy milyen előnyökkel jár, ha a plazma polielektrolit polimerrel végzett frakdonálása előtt a plazmához heparint adunk. Az eredmények azt is szemléltetik, hogy így a VIIIC faktor alvadási aktivitásának hozama reprodukálható módon megnő, mind a IX. faktor komplex eltávolítását szolgáló, az A jelzésű gyantával végzett kezelés után, mind pedig a B-jelzésű gyantára való adszorpdó és eludó után vagyis az aktivitásnak az eredeti plazmában mérhető szinthez viszonyított összhozama is magasabb. A VI11:C faktor aktivitását az ismert egylépcsős PTT meghatározási módszerrel mérjük, egy MLA Electra Cogaluation Timer-rel alvadási idő meghatározására szolgáló műzser, Medival Laboratory Automation, Inc., Ez a műszer optikai úton észleli azalvadás kezdetét. A műszer az alvadási sebesség második differendálját (vagyis az alvadási sebesség változásának sebességét) méri. A meghatározást a 3 486 981. számú maerikai szabadalmi leírásban ismertetett módon, a Dade Diagnostics, Inc. által szállított reagens- és felszerelés-csomag (kit) alkalmazásával végeztük. Ez a reagens-csomag VIII. faktor-hiányos plazmát és aktiválószerként eUaginsavat is tartalmaz. A vizsgált minták (frakciónál! minták) sorozathígításaira nézve kiszűrjük az alvadási idő-értékeket, és az eredményeket az eredeti plazma-mintákban mérhető VIIIC faktor aktivitáshoz viszonyítva a kinyert akitvitás %-os hozamként adjuk meg. E kísérletekben a VIIIC faktornak az eredeti plazmában mérhető, alvadási egységekben kifejezett aktivitását ml-enként 1 egységnek tekintjük. így minden kísérletben 200 alvadási egységből indulunk ki. A táblázatban megadjuk az egyes, gyantával végzett kezelések után mérhető kumulatív (összesített) egységek számát és az aktivitás kinyerésének %-os értékét. 189.708 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
