189708. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a VIII:C véralvadási faktor előállítására
1 2 szabad karboxilcsoporthoz és anhidrid-csoporthoz (1—4 szénatomos alkoxi, 1-5 szénatomos alkil-amino-csoportotk kapcsolódnak, 4. Az így kapott adszorbeált plazma-frakciót elválasztjuk a felülúszótól, és az adszorbeált plazma-frakcióból a VIII £ faktort elució útján elkülönítjük. A fentiekben említett rövid szénláncű alkii- és alkoxicsoportok 1—4 szénatomot tartalmaznak. Az exogén kifejezés olyan heparinra vonatkozik, amely nem a fenti műveleteknek alávetett vérplazmából vagy vérplazma-koncentrátumból származik. A fenti műveletekben alkalmazott heparin előnyös koncentrációja a plazma 1 ml térfogatú részletében 0,01 egység és 2 egység között van, és e koncéntráció-érték legelőnyösebben ml-enként 0,1 egység és 1,0 egység között van. A polielektrolit előnyös koncentrációja az 1. adszorpciós műveletben 0,03 súlyú és 0,04 súly% között van, míg a 3. adszorpciós műveletben 5 súly% és 6 súly% között. A jelen leírásban a heparin egységén az Egyesült Államok Gyógyszerkönyve (U.S.P.) által megadott egységet értjük. A heparinnak az Egyesült Államok Gyógyszerkönyve szerinti egysége a heparin azon mennyisége, amely meggátolja, hogy 1,0 ml, citráttal kezelt birka-plazma 0,2 ml 1:100 hígítású kalcium-klorid-oldat hozzáadása után 1 órán belül megalvadjon. A heparint általában emlősök olyan szöveteiből különítik el, amelyek hízósejteket tartalmaznak, ilyen szövetek például a tüdő és a máj szövetei. A jelen leírásban a heparin kifejezés a heparin gyógyászatilag elfogadható, vízoldható sót is, így például nátrium-sóját is magába foglalja. Alkalmas ilyen, a kereskedelemben kapható heparin-nátrium-só készítmények a Lipo-Hepín ® (Riker Laboratories), Liquaemin ® -Sodium (Organon) és Panheparin ® (Abbott Laboratories). A heparin alvadásgátló tulajdonságai Howell 1922-ben tett felfeldezése óta ismeretesek, lásd Amer J. Physiol., 63, 434435 (1922). Ma már ismeretes, hogy a heparin alvadásgátló hatását közvetett módon, egy plazma-kofaktor segítségével fejti ki. A heparin kofaktor, az antitrimbin III egy ct2 -globulm és szerin proteáz inhibitor (gátló), amely meggátolja, hogy a szerin proteáz enzim inaktiválja az alvadást előidéző faktorokat. Az antitrimbin III komplexeket képez a trombinnal, és ennek eredményeképpen mindkét fehérje inaktiválódik. A heparin jelentős mértékben megnöveli e reakció sebességét, de nem befolyásolja a reakció mértékét. A heparin Ids koncentrációban megnöveli az antitrombin III aktivitását, ez a heparint gyógyászati alkalmazásának alapja. Button és munkatársa (Transfusion, 3, 3740 1963/) leírták, hogy véradók véréhez a vér levétele és tárolása során heparint adtak. Az is ismeretes, hogy ha a tárolt plazmához heparint adnak, akkor ezzel meg lehet akadályozni, hogy a trombin inaktiválja a VIII. faktort (Rizza és munkatársai,Nature (London) 180, 143 (1957), és Stibbe és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 43-58 11973/). Jelenleg azonban a véradók véréhez alvadástátlóként nem heparint, hanem ACD-t (citrát-dextróz alvadásgátlót) vagy CPD-t (citrát-foszfát-dextróz-oldatot) vagy CPD plusz adenint (CPDA-1) adnak, hogy ezz,el megnöveljék a vörös vérsejtek túlélési idejét. Ezenkívül a heparinnal kezelt vérrel vizonyos vizsgálatokat nem lehet elvégezni, ilyen vizsgálatok például a komplementekkel, lzoagglutinnekkel és a vörös véísejtek stabilizásával kapcsolatos mérések. Ezért az ilyen vizsgálatokhoz használt vér mintáiból vagy el kell távolítani a heparint, vagy semlegesíteni kell azt. Habár már korábban is alkalmaztak heparint a vér olyan frakcionálási eljárásai során, amelyekben a jelen eljárásban használthoz hasonló típusú polielektrolit polimereket alkalmaztak, e korábbi eljárásokban a heparint az adszorbensről kapott eluátumhoz adták, majd ezután az eluátumot polietilén-glikollal frakdonálva állítottuk elő a IL, VIL, IX és X. faktorokat (protrombinkomplexeketilásd Á. J. Johnson és munkatársai, J. Láb. Óin. Med., 92 (a),'194-210 (1978). Amint ezt A. J. Johnson és munkatársai leírták, a heparint a protrombin komplex faktorainak polietilén-glikol segítségével való előállítása során a heparint arra használták, hogy biztosítsák a plazmában a heparin által aktivált antitrombin Hl jelenlétét, amely viszont gátolta az aktivált alvadási faktorok működését, lásd Thromb. Diath. Haemorrh., 34, N2,589 (1975). A korábban leírt módszerek ismertetése során nem javasolták a heparin alkalmazását a vérnek polielektrolit polimerek segítségével végzett frakcionálásához, amely frakcionálás eredményeképpen a jelen leírásban megadott magas hozammal lehet a Vili.G faktor koncentrátumot előállítani. A jelen találmány szerinti eljárásban heparin jelenlétében alkalmazott polielektrolit polimerek ismert vegyületek, amelyeket önmagában ismert módszerekkel, mégpedig a 3 554 985., 3 555 001., 4 118 554. és 4 157 431. számú amerikai szabadalmi leírásokban ismertetett módszerekkel lehet előállítani. így például az etilén, és maleinsav-anhidrid kopolimerizádója útján előállítható alap-polimert úgy állíthatjuk elő,hogy etilént és maleinsav-anhidridet valamely peroxid-katalizátor jelenlétében, valamely alkalmas oldószerben reagáltatunk. A kopolimerben előnyösen lényegében molárisán azonos mennyiségű etilén-egység és nahidrid-egység van jelen. Az etilén és maleinsav-anhidrid kopolimerizádója útján kapott alap-polimert ezután reagáltathatjuk valamely, két primer amino cső portot tartalmazó NJ4- -bisz-(rövidszénláncú amino-alkil)-rövidszénláncú alkil-aminnal, és így térhálósított, e til én-malein sav-anhidridkopolimerhez jutunk. Az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert 3 mól% és 10 mól% közötti menynyiségű térhálósító-szerrel kell reagáltatnunk. A polimer lánchoz kapcsolódó kívánt di-(rövidszénláncú alkil)-amino -rövidszéni án cú -alkii -imido -csoportotokat legalább 3 mól% mennyiségben úgy lehet a térhálósított kopolimerhez hozzákapcsolni, hogy az etilén-maleinsavanhidrid kopolimer összes, szabadon maradt anhidrid-csőportját vagy ezek egy részét di-(rövidszénláncú alkil)-amino-rövidszénláncú-alkil-aminnal reagáltatjuk. A jelen találmány szerinti eljárás 1. műveletében alkalmazott polielektrolit polimer adszorbens előállítása céljából előnyösen 90 mól% és 100 mól% közötti mennyiségű di-(rövidszénláncú alkil)-amino-rövidszénláncú-alkil-amint alkalmazunk, míg a jelen találmány szerint 3. műveletben alkalmazott adszorbens előállításához előnyösen valamely ilyen amin 3 mól% és 7 mól% közötti mennyiségét alkalmazzuk. Ez utóbbi polielektrolit polimer adszorbens esetében valamennyis szabadon maradó karboxilcsoportot vagy anhidridcsoportot a 4 157 431. szá189.708 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
