189708. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a VIII:C véralvadási faktor előállítására
1 2 A találmány tárgya eljárás a vér frakcionálására, és részletesebben a VIIIG véralvadási faktor (tényező) előállítására. A vér alvadása bonyolult élettani folyamat, amelynek során a normál teljes vérben jelenlévő számos anyag lép egymással kölcsönhatásba. Ismeretes, hogy egyes személyek vérében nincsenek meg bizonyos, a véralvadás mechanizmusával kapcsolatos, bizonyos faktorok. így például a klasszikus hemofiliában (vérzékenységben) szenvedő betegek vérében nincs antihemofiliás A faktor (AHF, VIII,faktor). A gemofilia B-ben szenvedő betegek véréből pedig a plazma tromboplasztin komponens (PTC, IX faktor) hiányzik. A hemofíliás betegek egy kis részének véréből hiányzik továbbá az úgynevezett Von Willebrand faktor is, amely a Vili. faktor lényeges komponense (összetevője). Ma általánosan elismert ténynek tekintik, hogy a VIII. plazmafaktor két komponense komplexe, és e két komponensnek különböző szerepe, különböző biokémiai és immunológiai tulajdonságai, valamint különböző genetikai kontrollja van. A VIII. komplex faktor egyik komponensének az antihemofiliás faktorra jellemző progoaguláns aktivitása van, ezt a komponenst általában VIII:C faktornak nevezik. A másik, nagyobb részét, ez a komponens úgy lép kölcsönhatásba a vérle mezkékkel, hogy ezáltal elősegíti az elsődleges hemosztázist. Ezt a komponenst általában VIIIR faktornak (rosztocetin kofaktornak vagy Von Willebrand antigénnek) nevezik. Az X-kromoszómán keresztül öröklött VIII:C faktor hiányban (hemofilia A-ban) szenvedő betegek vérében a VIIIR faktor normális módon keletkezik és működik. Az ilyen betegeknek nincs szükségük arra, hogy a hemosztázis fenntartásához külső VIIIR faktort kapjanak, és így elegendő, sőt egyes esetekben előnyös, ha VIIIR faktort nem tartalmazó VIIIG faktor koncentrátumot adagolunk nekik. A VIII. komplex faktor és két komponense szerkezetéről és működéséről további adatokat tartalmaz a közelmúltban megjelent három összefoglaló közlemény: Hoyer, J. Amer. Soc. of Hematol., 58 (1), 1-13 (1981), Harris és munkatársai, Biochim. Biophys. Acta, 668, 456470 (1981), és Fulcher és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 79, 1648-1652 (1982). A VIII. faktort tartalmazó koncentrátumok (sűrítmények) klinikai fontossága, valamint az a tény, hogy nagy mennyiségben szükség van ilyen készítményekre, arra ösztönözte a kutatókat, hogy javított módszereket dolgozzanak ki az ilyen vérfrakciók előállítására. A vér frakcionálására szolgáló, alacsony hőmérsékleten végrehajtott, ismert Cohn-féle alkoholos eljárás J. Am. Chem Soc. 68, 459475 (1946) helyett kidolgoztak különféle további módszereket, amelyek során a normális szobahőmérsékleten használható frakcionálószereket alkalmaztak. Az egyik ilyen eljárásban polimer polietilén-glikolt (PEG) alkalmaznak, amint ezt például a 3 631 018., 3 652 530. és 3 682 881. számú amerikai szabadalmi leírások ismertetik. Az említett szabadalmi leírásokban ismertetett módszer során azonban alkalmaznak egy krioprecipitációs (hidegen végzett kicsapási) műveletet, ezért ezt az eljárást a hidegen végzett műveletekhez szükséges berendezésekben kell végezni, és ennek során a VIII. faktor aktivitása lényegesen csökken. A 3 803 115., Re. 29 698., 4 203 891. és 4 289 691. számú amerikai szabadalmi leírásokban azt javasolták, hogy a Vili. faktor hozamának megnövelése céljából, az említett, polietilén-glikolt és krioprecipitációs művelet előtt kell az elegyhez hozzáadni. A VIII. faktor előállítására szolgáló, polietilén-glikolt, kriorecipitációs művelet és heparint alkalmazó, említett módszerekkel kapcsolatban nem írták le, hogy e módszerekkel a VIII. komplex faktortól megkülönböztethető VIII.G faktort tartalmazó koncentrátumot lehetne előállítani. Javasolták viszont, hogy az an tihemofiliás faktor, a von Willebrand risztocetin kofaktor és a fibronektin elválasztására szolgáló hidegen végzett kicsapást és kromatográfiát alkalmazó módszer során a plazmához heparint kell hozzáadni, lásd a 4 210 580 és 4 278 594. számú amerikai szabadalmi leírásokat. Az ismert, Cohn-féle alkoholos vérfrakcionálási eljárás egy további, javított változatát jelentette, az a módszer, amelynek során vízben oldhatatlan, térhálósított polielektrolit kopolimereket használtak adszorbensként, lásd például a 3 554 985., 3 555 001., 4 118 554. és 4 157 431 számú amerikai szabadalmi leírásokat, továbbá A. J. Johnson és munkatársai, J. Láb. Clin. Med., 92 (a), 194-210 (1978). E polimer anyagokat más szerekkel, mint például ditio-treittel, továbbá Sepharose CL4B-vel és Sephadex G-100-zal kombinálva alklamazták, és így VIIIR faktort gyakorlatilag nem tartalmú VIIIG faktor koncentrátumokat állítottak elő, lásd Harris és munkatársai, Biochim Biophys. Acta, 668,456470 (1981). Azt találtuk, hogy a VIIIG faktort tartalmazó koncentrátumot jó hozammal elő lehet állítani vérplazmának szobahőmérsékleten végzett frakcionálása útján oly módon, hogy bizonyos adszorpciós műveleteket végzünk, amely műveletekhez külső eredetű heparin jelenlétében, különböző, vízoldhatatlan, térhálósított polielektrolit kopolímert alkalmazunk. A jelen találmány értelmében a VIII.C faktort tartalmazó koncentrátum előállítására szolgáló eljárás az’alábbi müveleketből áll: 1. Vérplazmához vagy vérplazma-koncén hátúmhoz exogén (külső eredetű) heparin jelenlétében, 7,0 és 8,5 pH-érték mellett hozzákeverünk 0,01 súly% és 0,1 súly% közötti mennyiségű, etilén és maleinsav-anhidrid kopolimerizációja útján előállított, 3 mól% és 10 mól% közötti mennyiségű N,N-bisz-(rövidszénláncú amino-alkil)-rövidszénláncú alkil-aminnal térhálósított, olyan vízoldhatatlan polielektrolitot, amelynek polimer láncához 90 mól% és 100 mól% közötti mennyiségű di-(révidszénláncú alkil)-amino-rövidszénláncú alkil-imido-csoport kapcsolódik, 2. az így kapott, adszorbeált plazma-frakciótól eválasztjuk a felülúszó folyadékot, 3. az említett felülúszóhoz exogén heparin jelenlétében 5,5 és 6,5 közötti pH-érték mellett hozzákeverünk 1 súly% és 10 siÚy% közötti mennyiségű, etilén és maleinsav-anhidrid kopolimerizációja útján előállított, és 3 mól% és 10 mól% közötti mennyiségű, N,N-bisz-(rövidszénláncú amino-alkilj-rövidszénláncú-alkil-amin alkalmazásával térhálósított, olyan vízoldhatatlan polielektrolitot, amelynek polimer láncához 3 mól% és 7 mól% közötti mennyiségű di-(rövidszénláncú alkil)-amino-rövidszénláncú alkU-imldo-csoport kapcsolódik, továbbá a fennmaradó összes 189.708 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
