189706. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás interferon előállítására
1 189 706 2 Az interferon olyan fehérje, amely a celluláris anyagcserefolyamatok - így az RNS és fehérjeszintézis — befolyásolásával nem specifikus vírusellenes hatással rendelkezik, legalábbis a homológ sejtekben. Az interferonok potenciális vírus- és rákellenes gyógyszerként széles érdeklődésre tartanak számot. Számos interferon-típus ismeretes, így az alfa-(leukocita), béta-(fibroblaszt) és gamma-(immun)-interferonok. A jelen találmány alfa-interferonok előállítására vonatkozik. Az alfa-interferonok elsődleges forrásai az emberi fehérvérsejtek, de ezek révén nem biztosítható a klinikai célokra szükséges mennyiségű alfa-interferon. Újabban olyan eljárásokat írtak le, amelyekben az alfa-interferont transzformált emberi sejtekkel, nevezetesen emberi limfoblasztoid sejtekkel állítják elő. (Advances im Experimental Medicine and Biology 1978, 110, 61—74, J. Clinical Microbiology 1978, 7, 44—51), sőt legújabban az alfa-interferon nagyléptékű előállítását is megvalósították. (Antimicrobal Ágenst and Chemotherapy 1979 15,420- 427, Texas Report Bioi. Med. 1981—82. 41, 175— 178). A humán limfoblasztoid sejtekből való alfa-interferon előállítás lépései a következők: i) a limfoblasztoid sejtek tenyésztése alkalmas tápközegben, ii) induktor hozzáadásával a sejtek interferon-termelésre való serkentése, iii) az indukciót követően a sejtek inkubálása, majd iv) a képződött interferon kinyerése. Számos technika ismeretes az ilyen eljárással történő interferon előállítás hozamának növelésére. Az egyik ilyen módszer szerint például a limfoblasztoid sejteket„az indukció előtt bizonyos ideig „előkezelő szenei ’ vagy „stimulátorral” kezelik. így a 0 000 520 számú európai szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet az interferonhozam növelésére, amelyben az előkezelést karbonsavval vagy vannak sójával, nevezetesen nátrium-butiráttal végzik. Az irodalomban hasonló előkezeléses eljárások ismeretesek egy sor más vegyület alkalmazásával (Virology 1979, 99, 158—166, 0 008 391 számú európai szabadalmi leírás) is. Az ilyen módszereknél általában az indukció előtt a sejteket bizonyos ideig, például kb. 48 óráig kezelik, majd az indukció előtt az előkezelő szert eltávolítják. Egy más eljárás szerint az interferonhozam növelése elérhető úgy is, hogy a tenyésztett sejtek hőmérsékletét az indukció során, vagy utána csökkentik (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 1973, 70, 3909-3913, Japanese J. Microbiology 1974 18, 217-222, Microbiol. Immunol. 1980 24, 907-914, J. Gen Virology 1981 56 163-174). Az irodalomból korábban az volt ismeretes, hogy az előzőekben idézett „stimulátorok adagolása az indukció során vagy azt követően előnytelenül befolyásolja a sejtek interferonhozamát. Különösen vonatkozik ez a karbonsavakra, így például a vajsavra (Virology 1979 99, 158-166, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981 103,806—812). Azt találtuk, hogy bizonyos vegyületek (a továbbiakban hozamnövelő szerek (adagolása a limfoblasztoid sejtek indukciója során vagy röviddel azt követően, fokozza az interferonhozamot. A találmány ennek megfelelően elsősorban interferon előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, amelynek során az indukálható limfoblasztoid sejteket induktor hozzáadásával serkentjük interferon termelésére, azzal jellemezve, hogy a sejteket indukálásuk során, vagy röviddel azt követően találmányban ismertetett hozamnövelő szenei kezeljük. Az interferon előállításához a limfoblasztoid sejteket az igényeknek megfelelően választjuk, így például az emberek gyógykezelésére szánt interferon esetében rendszerint emberi sejteket alkalmazunk. Előnyösen használhatók fel ilyen célra a Namalwa sejtek vagy más alkalmas limfoblasztoid sejtvonalak. Tenyészetben elszaporítható limfoblasztoid sejtvonalak problémamentesen származtathatók emberi perifériás vérből eredő leukociták tenyészetéből közismert módszerekkel. (Hope, J. H., Home, M. K., Scott, W„ Int. J. Cancer, 1978, 3, 857— 866, Hope, J. H., Horne, M. K. Scott, W., Int. J. Cancer 1969, 4, 255-260, Chang, R. S., Golden, H. D., Nature 1971, 234, 359-360) Ennek megfelelően egészséges vagy beteg egyénekből egyaránj nyerhetők leukociták, amelyek vagy „spontán származtathatók, amennyiben már eleve fertőzöttek Epstein-Barr vírussal (EBV), vagy pedig EBV-sal nem fertőzött leukociták tenyészetéből származtathatók pl. köldökzsinór véréből nyert leukociták, amelyekhez EBV-t adunk. Limfoblasztoid sejtvonalak könnyedén nyerhetők Burkitt limfomában szenvedő betegek sejtjeiből, mivel ezek már eleve fertőzöttek EBV-sal. Egy bizonyos sejtvonalat, a Namalwát G. Klein professzor származtatta Stockholmban (Nyormoi, 0., Klein, G., Adams, A., Dombos, L., Int. J. Cancer 1973, 12, 396-408) egy ilyen nevű afrikai leánygyermek sejtjeiből. Úgy találták, hogy ennek a sejtvonalnak a sejtjei megfelelő serkentés esetén rengeteg interferont képesek termelni (Strander, H., Mogesen, K. E., Cantell, K., J. Gin. Microbiol. 1975, 1, Hőin, Christophinis, G. J., Stell, C. M. and Finter, N. B., J. Gen. Virol. 1981, 52, 169-171). Ennek a sejtvonalnak egy szubkultúráját 1975. januárjában kaptuk Dr. Ion Gressertől (Villejuif, Franciaország). Ekkor szoktatták a sejtvonalat 10% magzati boíjúszérummal kiegészített RMPI 1640 táptalajon való növekedéshez. A sejteket a Wellcome Research Laboratories cég kutatói szoktatták 5—7% 6—8 hónapos borjúkból származó szérummal kiegészített ugyanolyan táptalajon való növekedéshez és a tenyészetet 18 hónapon át hetenként kétszer-háromszor oltották át. Ezekből a sejtekből Alapbankot hoztak létre, amely most a Namalwa (WRL ebevezést viseli, számos, folyékony nitrogénben tárolt ampullával. A sejtek mentesnek mutatkoztak a myeoplazmás fertőzéstől és mbtákat helyeztek letétbe az ATCC (American Type Culture Collection) törzsgyűjteményben (1978. július 7-én CRL 1432. számon). A későbbi példákban Namalwa (WRL sejtek szerepebek, de a találmány éppúgy alkalmazható más Namalwa szubkultúrákra, valambt egyéb, alkalmas limfoblasztoid sejtekre is. A „hozamnevelő szer kifejezés mbden olyan vegyületre vonatkozik, amely az bdukció során vagy röviddel azt követően adagolva jelentősen növeli az bterferonhozamot a szer távollétében kapott értékhez képest. Nagyszámú különböző vegyület bizonyult hatékony hozamnövelő szemek. Ezek közül számosakat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
