189706. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás interferon előállítására
1 189 706 2 említettek korábban „stimulátorként” a sejtek indukciót megelőző előkezelésére. A legelőnyösebb stimulátorok azonban, az alkánsavak (különösen a vajsav) és sóik, valamint a szteroidok (például a dexametazon), nem hozamnövelő szerek, sőt csökkentik az interferonhozamot, amennyiben jelen vannak az indukció alatt vagy után. Az egyes hozamnövelő hatású vegyületeket a Friend-sejtek differenciálódását kiváltó hatással is rendelkeznek (jóllehet nem minden Friend-sejt van hozamnövelő hatása). (Kémiailag kiváltott patkány eritrolukémia differenciálódás, Reuben, R. C. és munkatársai, Biochemica et Biophysica Acta, 1980,605,325-346). Hatásos hozamnövelő szerek a következő vegyíiletek: N-Acetil-p-amino-fenol, Acetamid és adott esetben egy hidroxilcsoporttal helyettesített N-(l-6 szénatomos alkil- és dialkil)-acetamidok (pl. N-metil-acetamid, NJM-dimetil-acetamid, N-etil-acetamid, N,N-dietil-acetamid, N-butil-acetamid, N-acetil-6-hídroxi-hexil-amin), Acetanilid és rövid szénláncú alkoxi-acetanilidek (pl. p-etoxi-acetanilid), 4-8 szénatomos alkilén-bisz-acetamidok (mint például hexametilén-bisz-acetamid, pentametilén-bisz-acetamid, heptametilén-bisz-acetamid), N,N-Diemtil-hexánamid, Dimetil-szulfoxid, Rövid szénláncú alkánsav-amidok (pl.: propionamid, butiramid), Rövid szénláncú alkit-benzamidok (pl.: N-metil-benzamid), Rövid szénláncú alkil-2-imidazolidinonok (pl.: 1,3- -dimetil-2-imidazolidinon), 1- rövid szénláncú alkil-2-pirrolidinonok (pl.: 1-metil--2-pirrolidinon, 1 -etil-2-pirrolidinon, 2- Piperidon és 1-rövid szénláncú alkil-2-piperidonok (pl.: 1-metil-2-piperidon), Piridin-N-oxid, valamint Karamid- és tiokarbamid-származékok (pl.: tetrametil-tiokarbamid, rövid szénláncú alkil-karbamidok, amilyen például az 1-metil-karbamid, 1-etil-karbamid, 1-propil-karbamid, 1,1-dimetil-karbamid, 1,3-dimetil-karbamid, 1,3-dietil-karbamid). Különösen előnyös vegyületek a következők: N-acetil-p-amino-fenol, N,N-dimetil-acetamid, 1,3-dimetil-2-imidazolidinon, dimetil-szulfoxid, p-etoxi-acetanilid, hexametilén-bisz-acetamid, N-metil-acetamid, 1-iTK'til-piperidon, l-nn:til-2-pirrolidon, valamint tetrametil-karbamid. „ Az itt szereplő „rövid szénláncú alkil megjelölés 1-4 szénatomos alkilcsoportot jelent. Az interferontermelés érdekében a kiválasztott sejteket először is tenyészteni kell olyan körülmények között, amelyek a szakirodalom szerint az adott sejttípusnak vagy törzsnek megfelelnek. A humán limfoblasztoid sejtek - amilyen a Namalwa sejtvonal is — például jól nőnek a szérummal - ez általában 5-10 térfogatszázalék borjú- vagy lószérum — kiegészített RPMI 1640 tápközegben (MOORE, G. E., és munkatársai., J. Amer. Med. Assoc. 1967. 199, 519—524). A limfoblasztoid sejtekkel (például a Namalwa sejtekkel) történő interferontermelés során először is a sejteket addig tenyésztjük, amíg megfelelő koncentrációjú szuszpenziót kapunk. Az interferontermeléshez szükséges koncentrációk, körülmények, stb., a szakemberek körében közismertek és nyilvánvalóak. Ennek a lépésnek a során adagoljuk a hozamnövelő szert. Legjobb a szert az indukció során hozzáadni (azaz, amikor az indukáló anyagot, pl.: Sendai vírust adják a tenyészethez az interferontermelés kiváltása céljából) vagyis a hozamnövelő szer már eleve jelen lehet a sejtszuszpenzió tápközegében közvetlenül az indukálás előtt, vagy pedig közvetlenül az indukció után adandó a sejtszuszpenzióhoz. Mindazonáltal a találmány szerinti előnyös hatás akkor is tapasztalható, ha a hozamnövelő szer hozzáadása valamivel később, de az indukciót követő két órán belül történik. A hozam növelő szer alkalmazott mennyiségét a sejtvonalra gyakorolt toxieitása korlátozza, de ez a mennyiség olyan legyen, hogy növelje az interferonhozamot. A toxikus és a hozamnövelő hatás eredőjeként kapható optimális koncentráció az egyes hozamnövelő szereknél más és más, de általában 0,1 és 500 mM, előnyösen 1 és 200 mM, legelőnyösebben 5 és 50 mM között. Az indukció és az ezt követő inkubáció bármely ismert módon történhet az interferon termelés érdekében. A sejtek például újraszuszpendálhatók RPMI 1640 tápközegben — szérum nélkül, vagy 5 térfogatszázalék szérummal kiegészítve ) 0,25 és 6x10® sejt/ ml, előnyösen 0,5 és 3x10® sejt/ml koncentrációhatárok közé. Ezután alkalmas induktort — amilyenek a vírusok, így például a Sendai vírus (Johnston, M. D. J. Gen. Virol, 1981 56, 175—184) — adunk a sejtszuszpenzióhoz 5 és 200 Hemagglutinációs Egység/ml (HAU/ml), előnyösen pedig 20 és 50 HAU/ml közötti végkoncentrációban. Alapos keverés után a sejtszuszpenziót 34—37°C hőmérsékleten 12-48 órán át inkubáljuk. Például 35°C-on éjszakán át inkubálva a sejttenyészetet a keletkező interferon a sejtekből a tápközegbe kerül. Ezután a sejteket például centrifugálással eltávolítjuk és így nyers interferont tartalmazó felülúszóhoz jutunk, amely szükség esetén ismert módon tisztítható. (Hemagglutinációs egység meghatározása: Granoff A. és mtsai, Studies on the Interaction of the Large and Small Heamagglutinating Components of Newcartle Disease Viras with Red Blood Cells, J. Of Immunologie, 1954, 72, 329—339). A hozam növekedése a hozamnövelő szer használata esetén igen jelentős, a hozam elérheti a szer távollétében mért érték ötszörösét is. A hozamnövelő szer hatásmechanizmusa jelenleg még nem teljesen tisztázott. A bizonyítékok azonban arra utalnak, hogy az interferontermelés sebessége hosszabb ideig növekszik, mint a szer távollétében. Ez a jelenség annak tulajdonítható, hogy az interferon m-RNS hosszabb időn keresztül képződhet, vagyis valódi szuperindukcióról van szó. Ennek megfelelően a találmány egyidejűleg olyan interferon előállítási eljárásra is vonatkozik, amelynek során az indukálható limfoblasztoid sejteket induktor hozzáadásával serkentik interferon termelésére, azzal jellemezve, hogy az indukciót követően az interferon termelés sebességének növekedése jelentősen hosz-S 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
