189550. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán szérum-prealbumin N-terminális részével analóg szerkezetű, az immunológiai ellenállóképességet növelő hatású deka-, undeka-, dodeka- és tridekapeptidek előállítására
189 550 2 hidroxid-oldaiol adunk a teljes oldás biztosítására. Az igy kapott oldatot Hank-féle 7,2 pH-értékű, egyensúlyba hozott sóoldattal - amelyet a Difco Labs., Detroit Mich, cég által gyártott porított készítményből állítottunk elő - hígítjuk 1 : 100 arányban és így egy 0,106 mg/ml azatioprin-nátriumsól tartalmazó, 8,2 pH-értékü oldatot kapunk. Ezt az oldatot sterilizáló szűrön keresztül leszűrjük és fénytől elzárva hűtőszekrényben tároljuk. Az oldat stabilitását az optikai sűrűség 280 és 330 nm-néi történő mérésével ellenőrizzük. B) Magához a vizsgálathoz 6-8 hetes korú C57B1/6 Simonsen hím-egerek lép-sejtjeit alkalmaztuk; az egereket leölés és a lép kivétele előtt 7-30 nappal thymus-ektomiának vetettük alá. Az egyes lépeket homogenizáljuk és hideg Hank-féle kiegyensúlyozott hideg sóoldattal mossuk. A sejteket azután egy hűtött centrifugában 10 percig 200 g-mal történő centrifugálással tömörítjük. Végül egy egyesített sejt-szuszpenziót készítünk, amely ml-enként 40-60 • 106 nukleizált sejtet tartalmaz. Kontroli-sorozat A thymus-ektomizált lépsejtek azatioprin-nátriumsóval szembeni érzékenységének meghatározása céljából egy kontroli-sorozatban magát az azatioprin-nátriumsót titráltuk. Az A) szakasz szerint készített azatioprin-nátriumsó-törzsoldat 0,25 mijéből két párhuzamos hígítás-sorozatot készítettünk, a 25 /zg/kémcső és 1,56 pg/kémcső közötti koncentráció-tartományban. Minden egyes hígításhoz 0,1 ml fenti módon készített lépsejt-szuszpenziót (4,6 ■ 10® sejt kémcsövenként) adtunk. Vizsgálati sorozat A vizsgálandó peptid-oldatok 0,125 ml-es alikvot-részeiböl két párhuzamos hígítás-sorozatot készítettünk Hank-féle sóoldattal. Minden egyes hígításhoz 2,5 pg azatioprin-nátriumsót tartalmazó 0,125 ml Hank-féle sóoldatot és 0,1 ml fenti módon készített sejt-szuszpenziót adtunk. Mind a kontroli-sorozatot, mind a vizsgálati sorozatot 60 percig inkubáltuk 37 °C hőmérsékletű vízfürdőben. Alsever-oldattal (Grand Island Biological Co., „Gibco”, Grand Island, N.Y. USA) két nappal előbb elkészített 50%-os juh-eritrocita (SRBC) szuszpenziót 0,2 ml-jét 15 ml Hank-oldattal hígítottuk és e szuszpenzióból 0,125 ml-t adagoltunk mindegyik kémcsőbe. A sejteket lehűtött centrifugában 200 g-mal 5 percig tömörítettük, majd a tömörített sejteket 4 °C-on hűtöttük 90 percig, azután rotátorban 5 perces kezeléssel kíméletesen újra szuszpendáltuk őket és Malessez-hemoktiométerben megszámláltuk a rozettákat. Az aktivitást az a minimális peptidmennyiség mutatja, amely leg alább 50%-osan gátolta a rozettaképződést 2,5 /tg' kémcső azatioprin-nátriumsó jelenlétében. A ka pott eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze : Vizsgáit vegyületek Aktivitás* Nagymértékben tisztított prealbumin 7,5-31,2 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys- 6,25 CySH( + DTT) Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys- 25-50 CySH(-DDT) Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys- 125 CyS(Me) Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys- 7,8 CySH-Pro(+DTT) Gly-Pro-Thr-GIy-Thr-Gly-GIu-Ser-Lys- 15,6 CySH-Pro(-DTT) Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys- 97 Alá Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys- 125-250 Ala-Pro Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser- 31,2 Lys-Ala Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser- 125-250 Lys-Ala Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys- 1,95 Cys-Pro-Leu * A megadott aktivitás-számértékek azt mutatják, hogy a szóbanforgó anyag hány nanogrammja szükséges a rozettaszám 50%-os csökkenésének elérésére. A „( + DTT)” azt jelenti, hogy az illető peptideket ditiotreitol védőszerként való hozzáadásával vizsgáltuk; ugyanazon pepiidnek e védőszer hozzáadása nélkül végzett vizsgálatát „(-DTT)" jellé! jelöltük. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás az (I) általános képletű peptidek H-Gly-B-Thr-A'-Thr-A"-D'-Ser-Lys-X-Y (I) A" jelentése Gly, D-Ala vagy D-Leu, A" jelentése Gly vagy D-Ala, B jelentése Pro vagy Thz, D' jelentése Glu vagy Gin R jelentése hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport, mely utóbbi a lizilcsoport e-aminocsoportjának egyik hidrogénatomját helyettesíti, X jelentése Cys, Ala, ABU vagy Cys(Me), Y jelentése —OH, —NH2, Pro—OH, Pro-Leu—OH vagy Pro-Leu-Met—OH, azzal a megszorítással, hogy ha Y jelentése más, mint hidroxil- vagy aminocsoport, akkor B jelentése Pro, A' és A" jelentése Gly, D' jelentése Glu és X jelentése Alá, Cys vagy Cys(Me)- és gyógyászati szempontból elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletű védett peptidet (P')a-Gly-B-Thr-A'-Thr-A"-D'-Ser-Lys - X -(Y'),(S), (II) I I I I I I I (Pú, (P9b (P3)c (P2)b R I (P% (TM)d - ebben a képletben A', A", B, D', X és R jelentése egyezik a fenti meghatározás szerintivel, Y' jelentése —OH, —NH2, Pro, Pro-Leu, Pro- Leu-Met, Pro-OH, Pro-Leu—OH, Pro-Leu- Met— OH, mimellett az (I) általános képletnél az Y jelentése kapcsolatban adott korlátozó meghatározás értelemszerűen az Y'-re is vonatkozik, P1, P2, P3, P4 és P5 a peptidkémiában szokásos oldalláncvédőcsoportokat képviselnek, amelyekben 5 10 i 5 20 25 30 35 40 45 50 55 80 65 10
