189550. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán szérum-prealbumin N-terminális részével analóg szerkezetű, az immunológiai ellenállóképességet növelő hatású deka-, undeka-, dodeka- és tridekapeptidek előállítására
1 189 550 2 a fenti meghatározásnak megfelelő (I) általános képletű vegyület valamely sóját szervetlen bázissal vagy bázisos ioncserélővel való kezelés útján a megfelelő (I) általános képletű szabad polipeptiddé alakítjuk át. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák szemléltetik; megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre nincsen e konkrét példák tartalmára korlátozva. A) A gyantához kötött C-terminális aminosav előállítása 3,4 Boc-Ala—OH 26 ml etanol és 26 ml víz elegyével készített oldatát kb. 2,9 g cézium-karbonát kb. 10 ml vízzel készített oldatával pH = 7-re állítjuk be. Az oldószert csökkentett nyomáson elpárologtatjuk és a maradékot vízmentes etanolban szuszpendáljuk. Az etanolt csökkentett nyomáson ismét elpárologtatjuk és a maradékot nagyvákuumban 24 óra hosszat szárítjuk. A száraz maradékot 94 ml vízmentes dimetil-formamidban szuszpendáljuk és e szuszpenzióhoz 14,29 kg klórmetilpolisztirol-1 %divinilbenzol gyantát (1,05 mmol Cl/g gyanta, a Merrifield resin - Lab Systems Inc. gyártmánya) adunk. A szuszpenziót 50 °C hőmérsékleten 24 óra hosszat rázzuk, majd egy Büchner-üvegtölcséren leszűrjük. A gyantát a szűrőn felváltva dimetilformamid és víz 9 : 1 arányú elegyével és etanollal mossuk. Miután a gyantát mindkét oldószerrel már legalább háromszor mostuk, még háromszori mosást végzünk diklór-metánnal, majd a terméket vákuumban megszárítjuk. Ily módon 17,05 g Boc- Ala-gyantát kapunk. 1. példa A) Egy Beckman 990 peptid-színtetizáló készülék reakcióedényébe beadagolunk 9,524 g fenti módon előállított Boc-L-Ala-gyantát (8,38 mmol). Ehhez a hordozóra felvitt gyantához azután egymást követően, az alábbi szintézis-program szerint beadagoljuk a következő aminosavakat: I. lépés: mosás diklór-metánnal egyszer 1,5 perc 2. lépés: védöcsoporl-cltávolítás egyszer 1.5 perc 50% CF2C02H/CH2Cl2-vcl 3. lépés: védöcsoport-cllávolitás egyszer 30 pere 50% CF3C02H/CH2CI2-vel 4. lépés: mosás diklór-metánnal háromszor 1,5 perc 5. lépés: 10% trictil-amin/CH2Cl2 kétszer 1,5 pere6. lépés: mosás diklór-metánnal háromszor lj perc 7. lépés: N’-Bocaminosav-oldat ‘ egyszer hozzáadás 8. lépés: N.N'-diciklohcxil-karboegyszer hozzáadás diimid-oldal 9. lépés: öblítés diklór-metánnal egyszer kapcsolási és kapcsolás reakció 10. lépés: öblilés diklór-metánnal, egyszer 2 óra 1,5 perc hozzáadás 11. lépés: mosás diklór-metánnal háromszor 1,5 perc 12. lépés: mosás etanollal háromszor 1,5 perc 13. lépés: mosás diklór-metánnal háromszor 1,5 perc ' A fenti 1-13. lépések együttesen egy teljes kapcsolási ciklust képeznek egy aminosav kapcsolására; a reakció teljes lejátszódását az E. Kaiser és munkatársai [Anal. Biochem., 34, 595 (1970)] által leírt ninhidrines módszerrel ellenőrizzük. Az egyes kapcsolási reakciókhoz minden egyes védett aminosavat 2-3 moláris feleslegben adjuk a gyantához, diciklohexil-karbodiimid kíséretében, így a gyantát egymást követően az alábbi védett aminosavakkal kezeljük az egyes kapcsolási ciklusokban: 9,51 g Boc-Lys(Cbz)—OH, 5,13 g Boc-Ser(Bz)— OH, 8.43 g Boc-Glu(OBz)—OH, 4.38 g Boc-Gly—OH, 8.43 g Boc-Thr(Bz)—OH + 20% (újrakapcsolási kezeléshez), 4.38 g Boc-Gly—OH, 8.43 g Boc-Thr(Bz)— OH, 5.38 g Boc-Pro—OH, 4.38 g Boc-Gly—OH. A gyantát ezután kivesszük a reakcióedényből, diklór-etánnal mossuk és vákuumban megszáritjuk; ily módon 17,294 g védett polipeptid-gyantát kapunk. Ezt a polipeptid-terméket azután vízmentes cseppfolyós hidrogén-fluoriddal való kezelés útján hasítjuk le a gyantáról és egyben e művelettel eítávoiítjuk az összes védőcsoportokat. Ebből a célból 10,0 g védett polipeptid-gyantát és 10 ml anizolt viszünk be egy „Kel-F” reakcióedénybe és 0 °C hőmérsékleten 90 ml kobalt-fluoridról frissen ledesztillált vízmentes cseppfolyós hidrogén-fluoridot adunk hozzá. A hidrogén-fluoridot ezután vákuumban eltávolítjuk és a maradékot, amely hidrogén-fluorid-só alakjában tartalmazza a pepiidet, 10*3— 100 ml dietil-éterrel háromszor mossuk. A maradékot jégecetben oldjuk és liofilizáljuk, amikor is fehér por alakjában kapjuk a nyers polipeptidet. A fenti módon kapott nyers polipeptidet vízben oldjuk és egy acetát-alakban levő gyengén bázisos Ag3X4A gyantát tartalmazó ioncserélő-oszlopra visszük. A kívánt terméket tartalmazó eluátumfrekciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk; így 3,71 g nyers polipeptidet kapunk acetát-alakban. Ezt a peptidet végső tisztítás céljából nagynyomású folyadék-kromatográfiának vetjük alá, egy Liehroprep RP18 (fordított fázisú) hordozót tartalmazó 5 • 100 cm méretű oszlopon. A mintát beviszszúk az oszlopra, majd 97% víz és 3% acetonitril ekgyével (ez az oldat 0,03 mól ammónium-acetátot is tartalmaz, pH = 4,5) eluáljuk az oszlopot 19 ml perc sebességgel. Az eluálási műveletet az eluátumok 212 nm-nél mutatott ibolyántúli abszorpciója alapján ellenőrizzük és a frakciókat oly módon választjuk meg, hegy ezzel a termék maximális tisztaságát biztosítsuk. A csúcsértéket mutató frakciókat egyesítjük és vízből háromszor liofilizáljuk; ily módon tiszta HGiy-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-acetátot kapunk, amely bomlás közben 184 °C-on olvad; [a]j>5 = ~ 70,3° (c= 1, ecetsav). Aminosav-elemzés : Thr + Ser 2,5 (3), Gly 1.0 ( 1 ). Pro 1,0 (1), Gly 2,8 (3), Alá 1,1 (1), Lys 1,3 (I). B) A C-terminális aminosavat amid alakjában tartalmazó peptidek szintézisére benzhidrilaminopclisztirol-divinilbenzol-gyantát alkalmazunk. Az első aminosavat a fent leírthoz hasonló módon kapcsoljuk a reakcióedényben a gyantához, majd a rendes semlegesítési és kapcsolási műveletsort a 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 .55 60 65
