189550. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán szérum-prealbumin N-terminális részével analóg szerkezetű, az immunológiai ellenállóképességet növelő hatású deka-, undeka-, dodeka- és tridekapeptidek előállítására
1 2 189 550 A találmány szerinti peptidek előállítására különösen előnyösen alkalmazhatjuk a szilárd fázisú peptid-szintézist. E módszer esetében az aminosavak a-aminocsoportját valamely savak vagy bázisok iránt érzékeny 5 csoporttal védjük. Az e célra alkalmas védőcsoportoknak stabiloknak kell lenniök a peptidkötésképzés reakciókörülményei között, de könnyen eltávolithatóknak kell lenniök oly módszerekkel, amelyek nem bontják el a növekvő peptid-láncot és 10 nem racemizálják a jelenlevő királis központokat. Az alkalmas védőcsoportok példáiként (általában aminosavak védelmére) elsősorban a terc-butiloxikarbonil- (Boc), benziloxikarbonil- (Cbz), bifenilizopropiloxikarbonil-, 9-fluorenil-metiloxikarbo- 15 nil- (Fmoc), terc-amiloxikarbonil-, izoborniloxikarbonil-, a,a-dimetil-3,5-dimetoxi-benziloxikarbonil-, o-nitro-fenilszulfenil-, 2-ciano-terc-butiloxikarbonil- és hasonló csoportok, különösen pedig a terc-butiloxikarbonil-csoport (Boc) említhetők. Az oldalláncbeli funkcionális csoportok megvédésére a következő védőcsoportok alkalmazhatók :- a lizin e-aminocsoportjára : Cbz és Boc ;- a szerin és treonin hidroxilcsoportjára : benzil(Bz) és tetrahidropiranil-csoport (ezek étereket ké- 25 peznek);- a cisztein —SH csoportjára: p-metoxi-benzil-, benzil- vagy tritilcsoport (ezek tioétereket képeznek), továbbá alkil-diszulfidok vagy karbamoilcsoportok, mint etil-karbamoil- vagy acetamido-metil- 30 csoport ;- a glutaminsav és aszparaginsav karboxilcsoportjára: benzil-, 2,4,6-trimetil-benzil- vagy tercbutil-csoport (ezek észtereket képeznek). Az előállítandó peptid C-terminális aminosavát 35 egy megfelelő szilárd hordozóhoz kapcsoljuk. Szilárd hordozóként ehhez a szintézis-módszerhez olyan anyagokat alkalmazhatunk, amelyek közömbösek a lépésenkénti kondenzációs reakciók és a védőcsoport-eltávojítási reakciók reagenseivel és 40 reakciókörülményeivel szemben és emellett nem oldódnak az alkalmazott közegekben. Az alkalmas szilárd hordozók példáiként a következők említhetők : benzhidrilamino-polisztirol-divinilbenzolpolimer, klórmetilpolisztirol-divinilbenzol-poli- 45 mer, hidroximetilpolisztirol-divinilbenzol-polimer és hasonlók; különösen előnyös a klórmetilpolisztirol - 1 % divinilbenzol-polimer. Abban a különleges esetben, amikor az előállítandó peptid C-terminális helyzetében egy amid áll, különösen előnyösen al- 50 kalmazható hordozóként a P. Rivaille és munkatársai [Helv. Chim. Acta, 54, 2772 (1971)] által leírt benzhidrilamino-polisztirol-divinilbenzol-polimer. A klórmetilpolisztirol-divinilbenzol-típusú gyantákhoz való kapcsolás oly módon történhet, hogy 55 az N“-védett aminosavat, különösen a Boc-aminosavat cézium-, tetrametil-ammónium-, trietilammónium-, 1,5-diazabiciklo[5.4.0]undec-5-énvagy hasonló só alakjában, etanolban, acetonitrilben, N,N-dimetil-formamidban vagy hasonló kő- 60 zegben (céziumsó esetében előnyösen dimetilformamidban) reagáltatjuk a klórmetil-gyantával ; ezt a reakciót felemelt hőmérsékleten, például 40 °C és 60 °C között, előnyösen 50 °C körül, körülbelül 12-48 óra, előnyösen körülbelül 24 óra reakcióidővei folytatjuk le. Az N’-Boc-aminosavat benzhidrilamin-típusú gyantákhoz N,N’-diciklohexil-karbodiimid (DCC) és 1-hidroxi-benzotriazol (HBT) alkalmazásával kapcsoljuk, körülbelül 2 óra és 24 óra közötti, előnyösen 12 óra körüli reakcióidővel, körülbelül 10 °C és 50 °C közötti, előnyösen 25 °C hőmérsékleten, mimellett oldószerként dimetilformamidot vagy előnyösen diklór-metánt alkalmazunk. A következő védett aminosav hozzákapcsolását automatikus polipeptid-szintetizáló készülékben folytatjuk le, a szakmabeliek által jól ismert módon. Az N’-védőcsoportok eltávolítása például diklór-metános trifluor-ecetsav-oldatban vagy dioxános vagy ecetsavas hidrogén-klorid-oldatban vagy más erősen savas oldatban történhet; előnyösen 50% trifluor-ecetsavat tartalmazó diklórmetánban dolgozunk, a szobahőmérséklet körüli hőmérsékleten. Mindegyik védett aminosav hozzákapcsolását előnyösen körülbelül 2,5 moláris felesleg alkalmazásával végezzük és a kapcsolási reakciót diklór-metánban, diklór-metán és dimetilformamid elegyében, dimetil-formamidban vagy hasonlóban, különösen azonban diklór-metánban, a szobahőmérséklet körüli hőmérsékleten folytatjuk le. Kapcsolószerként általában diciklohexilkarbodiimidet alkalmazunk diklór-metánban, alkalmazhatunk azonban N,N’-diizopropil-karbodiimidet vagy más karbodiimidet is önmagában vagy HBT, N-hidroxi-szukcinimid vagy más N-hidroxiimid vagy oxim jelenlétében. Alkalmazhatunk azonban a kapcsolási reakciókhoz védett aminosavakat aktív észter (például p-nitro-fenil-, pentafluor-fenil- vagy hasonló észter) vagy szimmetrikus anhidrid alakjában is. A szilárd fázisú szintézis befejeztével a teljesen védett polipeptidet eltávolítjuk a hordozóként alkalmazott gyantáról. Ha a hordozó gyantához a polipeptid benzilészter-típusú kötéssel kapcsolódik. akkor a C-terminuson savamidot tartalmazó peptidet eredményező lehasítási reakciót alkoholos (például metanolos vagy etanolos) ammónia-oldattal folytatjuk le, körülbelül 10-50 °C, előnyösen 25 °C hőmérsékleten, 12-24 órai, előnyösen 18 órai reakcióidővel. Ugyanilyen termékhez juthatunk azonban oly módon is, hogy a C-terminuson észtert tartalmazó terméket eredményező hasítási reakciót folytatunk le, majd a kapott terméket aminolízisnek vetjük alá. A szabad pepiidnek a gyantáról való lehasítása a védőcsoport egyidejű eltávolításával oly módon történhet, hogy az anyagot cseppfolyós hidrogénfluoriddal és anizollal kezeljük, körülbelül - 10 °C és + 10 °C közötti hőmérsékleten, körülbelül 15 perc és 1 óra közötti, előnyösen 30 perc körüli reakcióidővel. Az oldalláncbeli védőcsoportok lehasítása például vízmentes cseppfolyós hidrogén-fluoriddal, anizol vagy más karbónium-lehasító jelenlétében történhet a fent leirt módon; alkalmazhatunk azonban erre a célra hidrogén-fluorid-piridin komplexet, trisz-(trifluor-acetil)-bórt és trifluor-ecetsavat is kezelőszerként, történhet továbbá a védőcsoport-lehasítás palládiumos aktívszén vagy polivinil-pirrolidon jelenlétében történő hidrogénezéssel.
