189548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-4696 antibiotikum-komplex és egyes komponenseinek előállítására
1 189 548 2 Komponens Mennyiség, % Nutrisoy liszt 1,5 kukoricakeményítő 2,0 CaC03 0,1 Sag 471 0,05 A beoltott „ugrató” táptalajt 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk, körrázógépen (250 ford./perc), állandó rázatás mellett. Az „ugrató” közeg 0,4-0,4 ml-nyi mennyiségével 100 ml alábbi összetételű termelő táptalajt oltunk be, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban (sterilezés; 121 °C, 30 perc). Komponens Mennyiség, % cerelóz 1,0 kukoricakeményítő 3,5 szacharóz 3,0 melasz 1,5 élesztő 1,0 Proflo (gyapotmagliszt) 1,0 CaCOj 0,2 k2hpo4 0,05 (NH4)2S04 0,025 MgS04 • 7H20 0,5 Sag 471 0,03 A termelő közeget kb. 96 órán át rázatjuk 30 °C hőmérsékleten, 250 ford./perc sebességgel üzemelő rázógépen. A fermentációs ciklus végén a pH kb. 8,0. Az A-4696 antibiotikum B3 és E, komponense előállítására az ATCC 31683 törzset alkalmazzuk; az „ugrató” táptalaj előállítása az előbbiek szerint történik. Az ATCC 31683 törzs „ugrató” tenyészetének 0,4-0,4 ml-ével 100 ml alábbi összetételű termelő táptalajt oltunk be, 500 ml-es Erlenmeyerlombikokban (sterilezés: 121 °C, 30 perc). Komponens Mennyiség, % cerelóz 1,0 élesztő 2,0 . CaC03 0,2 k2hpo4 0,05 (NH4)2S04 0,025 Sag 471 0,03 A termelő fermentációs tenyészetet kb. 96 órán át rázatjuk 30 °C hőmérsékleten, 250 ford./perc sebességgel üzemelő rázógépen. A fermentációs ciklus végén a pH kb. 8.0. B) 40 literes fermentorban végzett fermentáció Az inokulum előállítását az A) pontban leírtak szerint végezzük, az „ugrató” táptalaj beoltásával bezárólag. 25 liter fenti összetételű termelő táptalajt autoklávban 121 °C-on 30 percen át sterilezünk és átviszünk egy 40 liter térfogatú fermentorba. A steril termelő táptalajt 100 ml „ugrató” tenyészettel oltjuk be. A beoltott termelő táptalajban 4 napon át 30 ^C-on folytatjuk a fermentációt. A levegőztetést steril levegővel végezzük, kb. 0,5 térf. levegő/térf. táptalaj/perc mennyiségben. A fermentációs táptalajt - a levegő és a közeg megfelelő elegyedése biztosítására - lapátos keverővei kevertetjük. A tenyésztő közeg pH-ja a kiindulási szintről - kb. 6,5 - folyamatosan növekszik a fermentáció előrehaladásával, kb. 8,0-ra. C) Az A-4696 antibiotikum elkülönítése Az előbbi eljárással előállított 3800 liter térfogatú fermentlevet 5 súly/térf. % szűrési segédanyag (Celite 545) hozzáadása után szűrünk. A szűrőlepényt 3600 liter ionmentes vízben felszuszpendáljuk és a vizes szuszpenzió pH-ját vizes nátriumhidroxid alkalmazásával 10,5-re állítjuk be. A szuszpendált szilárd fázist szűréssel elkülönítjük és vízzel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékokat egyesítjük és a kapott oldatot 20 súly/térf. %-os vizes kénsavval megsavanyítjuk, pH 4,5-re. A savas oldatot 1 % szűrési segédanyag (Celite 545) alkalmazásával szűréssel derítjük. A tiszta oldatot 1,8 x 5 láb méretű oszlopon vezetjük át, amely 350 liter Amberlite IR-116 gyantát (Na+ alakban) tartalmaz és az oszlopot ionmentes vízzel (1200 liter) mossuk. Az IP—116 gyantát eltávolítjuk az oszlopból és szakaszosan - összesen 1000 liter - vizes nátriumhidroxid-oldattal (pH 10,5) eluáljuk. A gyanta eluátumát semlegesítjük (pH 7), 20 súly/térf. %-os vizes kénsav-oldat felhasználásával, majd három részletben mossuk összesen 150 liter ionmentes vízzel. A vizes mosófolyadékokat semlegesítjük és egyesítjük a semlegesített eluátummal. A kapott oldatot betöményítjük, majd fagyasztva szárítjuk. A nyers komplex színe cserszínű és sötétbarna között változik. D) A sók eltávolítása a nyers A-4696 antibiotikumból A nyers komplexet (1,0 kg) lassan, erőteljes kevertetés mellett ionmentesített vízhez (1,5 liter) adjuk hozzá. A kapott szuszpenziót 20 percen át kevertetjük, majd 10%-os vizes ammóniumhidroxid oldat alkalmazásával semlegesítjük (pH 7). Az oldhatatlan A-4696 antibiotikum komplexet vákuumszűréssel elkülönítjük, ionmentes vízzel mossuk és fagyasztva szárítjuk. Közel 80%-os kitermeléssel (a biológiai aktivitás alapján) kapjuk a szárított, sómentes komplexet. E) A sómentesített A-4696 antibiotikum komplex tisztítása A szárított, sómentesített komplexet (300 g) ionmentes vízben (2 liter) oldjuk és a szuszpenzió pH- ját 3N vizes sósav hozzáadásával 2,7-re állítjuk be. A megsavanyított oldatot 40 percen át 2500 ford./ perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót dekantáljuk és rávisszük egy oszlopra (8 x 85 cm), amely 6 liter színtelenítő gyantát (Duolite S761) tartalmaz. Az aktív anyagot ionmentes vízzel eluáljuk, 30 ml/perc áramlási sebességgel. Az eluciót vékonyrétegkromatográfiával követjük. Az A-4696 antibiotikumot tartalmazó effluenst betöményítjük (3 mm, 35 °C) 3 liter térfogatra és fagyasztva szárítjuk. A színtelenített komplexet fehér-cserszinű anyag alakjában nyerjük ki, kb. 70%-os kitermeléssel (a biológiai aktivitás alapján). 5 10 1:5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
