189548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-4696 antibiotikum-komplex és egyes komponenseinek előállítására
1 . 189,548 2 F) Az A-4696 antibiotikum B,, B2, B3, Cla, C3 és E, komponense hidrokloridjának kinyerése. 10 g szárított, színmentesített A-4696 antibiotikum komplexet 100 ml ionmentes vízben oldunk. A kapott vizes oldatot szűrjük és felvisszük egy kromatográfiás oszlopra (5 x 100 cm), amely 2 liter poliamidot (Machery and Nagel SC6) tartalmaz. Az oszlopot ionmentes vízzel eluáljuk és 200-300 ml térfogatú eluátumot (25-25 ml-es frakciókból) gyűjtünk össze. Az eluciót az UV-aktivitás alapján és vékonyrétegkromatográfiával követjük. A vékonyrétegkromatográfiás azonosság alapján egyesítjük a frakciókat és fagyasztva szárítjuk ezeket. Egyes elkülönítési műveletek esetében az oszlop hosszúságát meg kell kétszereznünk (200 cm), a két poliamid oszlop sorbakapcsolásával. A további tisztítás a kromatografálás ismétlésével érhető el. Az előbbi A)-F) pontban részletezett műveleteket hajtjuk végre az ATCC 31682 törzs alkalmazása esetén, amikor az A-4696 antibiotikum B, és Cla komponens elkülönítését kívánjuk elérni; az ATCC 31680 törzs alkalmazása esetén, amikor az A-4696 antibiotikum B2 és C3 komponensét kívánjuk elkülöníteni és az ATCC 31683 törzs alkalmazása esetén,'az A-4696 antibiotikum B3 és E] komponensének elkülönítésére. Bár az említett komponensek elkülönítésére más Actinoplanes törzseket is alkalmazhatunk, a tárgyalt törzseket előnyben részesítjük az A-4696 antibiotikum komponensek elkülönítése szempontjából, amelyek előállítása a találmány tárgyát képezi. A következőkben írunk le egy másik eljárást az A-4696 antibiotikum B,, B2, B3, C,a, C3 és E, komponense - hidroklorid alakban történő - elkülönítésére, egyetlen Actinoplanes missouriensis törzs felhasználásával: 200 mg szárított, színtelenített A-4696 antibiotikumot - amelyet, komplexként, a 31683 törzs alkalmazásával állítunk elő, az 1. példa A)-F) pontja szerint - kb. 2 ml desztillált vízben oldunk. A kapott vizes oldatot szűrjük és oszlopkromatográfiával különítjük el a komponenseket, fordított fázisú adszorbensek - pl. a Li ChroprepR RP-18 (E. Merck, Darmstadt, NSZK)-stacionárius fázisként való alkalmazásával, mobilis fázisként trietilaminfoszfátot tartalmazó vizes acetonitril oldatokkal. A szakember számára ugyan nyilvánvaló, hogy az acetonitril oldatok koncentrációját (illetve a koncentráció-gradienst) az adott fermentációs termék összetétele függvényében változtatni kell, mégis jelezzük, hogy egy kitüntetett koncentráció-gradiens a 10-40%. Az oszlopról távozó folyadékot az UV- aktivitás alapján követjük és felfogjuk az egyes komponenseket tartalmazó frakciókat. Az acetonitrilt magas vákuumban ledesztilláljuk és fagyasztva szárítjuk a kapott vizes oldatokat. A fagyasztva szárított kromatográfiás frakciókat ezután desztillált vízben újra oldjuk, fordított fázisú adszorbensen - ilyen pl. a Sep PakR C18 patron (Waters Associates Inc., Milford, Massachusetts) - adszorbeáltatjuk és 50%-os vizes metanollal eluáljuk. Az egyes A-4696 antibiotikum komponenseket tartalmazó vizes oldatokat szárazra pároljuk és a tisztított A-4696 antibiotikum komponenseket száraz amorf termék alakjában nyerjük ki. 2. példa Az A-4696 antibiotikum B,, B2, B3, C,a, C3 és E, komponense szulfát alakban való előállítása 300 mg A-4696 antibiotikumot - amelyet az 1. példa A)-D) pontja szerint állítunk elő - 2 liter ionmentesített vízben oldunk és a szuszpenzió pH- ját 3N vizes kénsav hozzáadásával 2,7-re állítjuk be. A megsavanyított oldatot 40 percen át 2500 ford./perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót dekantáljuk és felvisszük egy oszlopra (8 x 85 cm), amely 6 liter színtelenítő gyantát (Duolite S761) tartalmaz. Az aktív anyagot ionmentesített vízzel eluáljuk 30 ml/pere áramlási sebesség mellett. Az eluciót vékonyréteg-kromatográfiával követjük. Az A-4696 antibiotikumot tartalmazó effluenst 3 liter térfogatra töményítjük be (3 mm, 35 °C) és fagyasztva szárítjuk. A színtelenített komplexet fehér-cser színű szilárd anyag alakjában nyerjük ki, kb. 70%-os kitermeléssel (a biológiai aktivitás alapján). Az egyes A-4696 antibiotikum komponenseket B,, B2, B3, C,a, C3 és E! szulfát - az I. példa F) pontja szerinti eljárással különítjük el. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás A-4696 antibiotikum komplex és B,, B2, Bj, C,a, C3 és E, komponenseinek előállítására, azzal jellemezve, hogy az ATCC 31680, ATCC 31682 vagy ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzset asszimilálható szénhidrát- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajban süllyesztett aerób fermentációs körülmények között tenyésztjük, majd a komplexet elválasztjuk a tenyészléből, és kívánt esetben a komplexet önmagában ismert módon komponenseire választjuk szét. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A-4696 antibiotikum B, komponense vagy ennek egy gyógyászatiig elfogadható savaddíciós sója előállítására, amely komponens hidroklorid alakban fehér, kristályos anyag, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és oldhatatlan éterben, kloroformban, benzolban, acetonban, alifás szénhidrogénekben és klórozott szénhidrogénekben; közelítő összetétele 51,51% szén, 5,25% hidrogén, 4,88% nitrogén, 4,62% klór és a fennmaradó hányad oxigén; közelítő elméleti mokekulasúlya 1954; UV abszorpciós maximumot mutat vízben 280 nm-en, amelynek értéke E| 42,8; és a következő megkülönböztethető sávokat mutatja a KBrben felvett IV abszorpcós spektrumban : 3380 széles, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637. 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012,982, 880, 842, 831 és 810 cm“1, azzal jellemezve, hogy ezt a komponenst az ATCC 31682 vagy ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzs által termelt A- 4696 komplexből különítjük el. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A-4696 antibiotikum B2 komponense vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sója előállítására, amely komponens hidroklorid alakban fehér, kristályos anyag, amely oldható vízben, hidroxiles 5 10 15 20 25 30 3b 40 45 50 55 60 65 13
