189519. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2'''-O-demetil-makrocin-származékok előállítására
189 519 2 gólunk, ezek közönséges sók, például vas-, kálium-, nátrium-, magnézium-, kalcium-, ammonium-, klorid-. karbonát-, szulfát- és nitrát-ionokra disszociáló sók. A mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges eszenciális nyomelemeket is tartalmaznia kell a táptalajnak. Ezek a nyomelemek általában szennyező anyagként jelen vannak a táptalaj más összetevőiben, mégpedig a mikroorganizmus növekedési igényének megfelelő mennyiségben. A nagyméretű fermentációkor, habzáskor szükséges kevés (például 0,2 ml/l) habzásgátló szer, például polipropilén-glikol (molekulasúlya körülbelül 2000) adagolása. Nagymennyiségű DOMM vagy dihidro-DOMM előállítására süllyesztett, levegőztetett fermentációt végzünk tankfermentorban. Kevés DOMM vagy dihidro-DOMM előállítható rázott tenyészetben is. Az antibiotikum-termelésben mutatkozó lag-fázis miatt a nagyméretű tankfermentorokat nem a mikroorganizmus spóráival oltjuk, hanem előnyösen vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokulum előállítására kevés táptalajt beoltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micéliumaival, ebből friss, aktívan növekvő tenyészetet kapunk. Ezután beoltjuk azzal a vegetatív inokulummal, a nagyméretű tankfermentorban lévő táptalajt. A vegetatív inokulum előállításához használt táptalaj a főfermentációs táptalajjal azonos lehet, de használhatunk más táptalajt is. Az S. fradiae ATCC 31 669 10 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten nő. Az antibiotikum-termelés szempontjából az optimális hőmérséklet 28 °C. Ahogy az a levegőztetett, süllyesztett, fermentációs folyamatoknál szokásos, a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A legtöbb antibiotikum akkor bioszintetizálódik, ha a tankfermentorban lévő táptalaj levegőtelítettsége 30%, vagy ennél nagyobb (28 °C hőmérsékleten és 1 atm nyomáson). Az antibiotikum-termelést a fermentáció során oly módon követjük, hogy a tenyészlevel az antibiotikumokkal szemben érzékeny mikroorganizmusokkal vizsgáljuk. Ilyen, alkalmas mérőorganizmus a Staphylococcus aureus ATCC 9144. A biológiai értékmérést ismert módon, automatizált turbidimetriás módszerrel végezzük. Az aniibiotikumtermelésl ezenkívül a kiextrahált fermenllé ultraibolya abszorpciós spektrumának felvételével is követhetjük. A termelést ezenkívül nagyfelbontású folyadék-kromatográfiával (UV-detekció) is követhetjük (lásd például Kennedy, J. Chromatographic Science, 16, 492-495., 1978.). A süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények közötti tenyésztést követően a DOMM-t vagy a dihidro-DOMM-t a fermentációs iparban ismert módszerekkel különíthetjük el a táptalajból. A DOMM és a dihidro-DOMM elkülönítését úgy kezdjük, hogy szűrjük a tenyészlevet. A szűrt levet ezután az előállítandó antibiotikum izolálására tovább tisztítjuk. A tisztítás során különböző módszereket használhatunk. A szűrt lé egyik előnyös tisztítási módszere szerint úgy járunk el, hogy 9-re állítjuk be az oldat pH-ját, megfelelő oldószerrel, például etil-acetátlal, amil-acetáttal, vagy metilizobutil-ketonnal extraháljuk az oldatot, a szerves fázist elkülönítjük és vizes, savas oldattal extraháljuk, és ezt követően a vizes extrakt pH-ját báz.ikusra állítva kicsapjuk az antibiotikumot. A továbbiak során a tisztítást extrakcióval, adszorpcióval és/ vagy kristályosítással végezzük. Ahogy az más mikroorganizmusoknál is megfigyelhető, a Streptomyces fradiae ATCC 31 669 törzs tulajdonságai is variálnak. Például mesterséges variánsok és mutánsok nyerhetők az ATCC 31 669 törzsből oly módon, hogy különböző ismert fizikai és kémiai mutagénekkel kezeljük, például ultraibolya sugarakkal, X-sugarakkal, gammasugarakkal, N-metil-N'-nitro-N-nitrozó-guanidinnel. A Streptomyces fradiae ATCC 31 669 összes olyan természetes és mesterséges variánsa és mutánsa és rekombinánsa, amely megtartja a DOMM termelő képességet, a találmány szerinti eljárás során használható. A DOMM különböző vegyületei gátolják a pafogén baktériumok, különösen a Gram-pozitív festödésü baktériumok és a Mycoplasma fajok növekedését. Ily módon a találmány egyik további tárgya eljárás bakteriális fertőzések, különösen a Gram-pozitív festődésű baktériumok és a mycoplasmák által okozott fertőzések gátlására, kontrollálására vagy kezelésére a találmány szerinti új vegyületekkel. A III. táblázatban megadjuk a standard agarhigításos méréssel meghatározott legkisebb növekedésgátló koncentrációkat, amely koncentrációk mellett a DOMM (szabad bázis) gátolja bizonyos baktériumok növekedését. Ili, Táblázat A DOM M szabad bázis in vitro aktivitása I o-îkiM.-1'h IUH L'krtkv Mikroorganizmus gallo koncentraao (Mg ml) Streptococcus pyogenes C203 0.25 Streptococcus pneumoniae Park 1 0.25 Streptococcus sp. (D-csoport) 282 4.0 Pasteurella múltoddá 12.5 Pasteurella hemolylica 50.0 Mycoplasma galliseplicum 0.78 Mycoplasma hyopneumoniae 0.78 Mycoplasma hyorhinis 3,12 A DOMM vegyülelek in vivo anlimikrobiális aktivitással rendelkeznek, kísérleti bakteriális fertőzésekkel szemben. Ha kísérleti úton fertőzött egereknek két dózisban adagoljuk a vizsgált vegyüleleket, az aktivitást ED50-értékben kapjuk meg (hatásos dózis mg/kg-ban. amely a vizsgált állatok 5()%át megvédi a fertőzéstől: lásd Wick és munkatársai. J. Bacteriol., Hl. 233 235. 1961). A DOMM-re vonatkozóan mért HDj,.-értékeket a IV. táblázatban adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
